本发明专利技术公开了一种新型重组复合干扰素的基因，并提供了该基因的高效表达载体，其保藏号为：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３７９。相对于已有的复合干扰素，这种通过定点突变筛选得到的新型重组复合干扰素在理化性质上有明显差异、活性提高１０倍，具有更高的抗病毒、抗感染能力。所用的高效表达载体相对已经发表的发明专利技术大大提高了目标蛋白的表达量。本发明专利技术还公开了上述重组复合干扰素的制备方法。
Construction of a new recombinant interferon and its efficient expression vector
The invention discloses a novel recombination interferon gene, and provides an efficient expression vector for the gene, wherein the number is CGMCC No.2379. Compared with the existing composite interferon, there are significant differences in the physicochemical properties of novel recombinant consensus interferon which screened by site directed mutagenesis activity increased 10 times, with higher antiviral and anti infection ability. The efficient expression vector has greatly improved the expression of the target protein compared with the published invention. The invention also discloses the preparation method of the recombinant composite interferon.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组复合干扰素的序列改造和高效表达载体的构建和表达。技术背景干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性的细胞素的总称， 被广泛应用于临床治疗肝炎，炎症与癌症。哺乳动物的干扰素有α、β、Y三种型别，其中的α-干扰素又分为多种亚型。八十年代初，科学家们比较了当时已查明的13中α-干扰素的氨基酸序列及其功能之后，发现它们具有很多相同之处，说明它们的相似的生物活性与功能；同时它们又具有各自特异之处，这就决定了它们各自的作用专一性。综合这些相同与相异之处，美国安进公司(Amgen)设计出一种综合各种天然干扰素的优点的全人工干扰素——复合干扰素 (Consensus interferon)。复合干扰素具有天然干扰素无法匹配的优点·Λ.复合干扰素集中了各种天然干扰素的优点，故而具有更强、更广谱的抗病毒作用。例如，在治疗丙型肝炎方面，干扰素α _2b的有效率略大于50%，但其中近三分之二的病人停药后病情复发，因而其净治愈率只有15-20%。与其呈鲜明对照的是，复合干扰素的治愈率高达40%。B.对天然干扰素α "2b无法治疗的病人，复合干扰素的治愈率达17%左右；而对干扰素α -2b治疗后复发的病人，复合干扰素的治愈率高达50%。安进公司开发的复合干扰素于1997年获美国FDA批准上市，商品名Infergen，临床上用于治疗对干扰素α-2b治疗无效的丙型肝炎。中国四川省生物工程研究中心于2001年申请了 “重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂”的国际专利保护(公开号WO 02/80958A1)。从已发表的复合干扰素的专利文件中，我们注意到，复合干扰素的表达量并不理想，每升发酵液中只有100毫克的复合干扰素蛋白，以包涵体的形式存在，经变性、复性、纯化后才能得到纯度较高的目的蛋白，其总纯化效率很低。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种低成本高量表达高活性复合干扰素的表达方法。通过定点突变和功能筛选，以得到活性比已有复合干扰素更高的重组复合干扰素。本专利技术的另一个目的是提供一种用于本专利技术的方法的表达载体。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一个表达复合干扰素的载体。含有该表达载体的大肠杆菌宿主细胞大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-CI已于2008年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。保藏号CGMCC NO. 2379。本专利技术还提供了利用上述表达载体在大肠杆菌中表达复合干扰素的方法。该方法包括用本专利技术的表达载体转化宿主细胞，和培养转化的宿主细胞的步骤。利用本专利技术的上述技术方案，复合干扰素的表达量达到500毫克/升。附图说明图1是重组复合干扰素、复合干扰素和干扰素α -2b对比的SDS-PAGE电泳检测图谱。各泳道分别为=I-Amgen公司复合干扰素；2-干扰素α -2b ；3-重组复合干扰素；4_标准分子量蛋白。图2是筛选得到的重组复合干扰素与Amgen公司复合干扰素的活性比较图。其中 Con-IFN为重组复合干扰素、control为Amgen公司复合干扰素。图3是分离重组复合干扰素的离子交换层析图谱，目标蛋白用箭头标出。图4是分离重组复合干扰素的凝胶过滤层析图谱，目标蛋白用箭头标出。图5是重组复合干扰素制备过程的SDS-PAGE电泳检测图。各泳道分别为1_未诱导表达的对照；2-50 μ 1发酵诱导表达液；3-包涵体洗涤液1 ；4-包涵体洗涤液2 ;5_洗涤后包涵体复性液；6-标准分子量蛋白质；7-离子交换层析后，含还原剂；8-离子交换层析前透析步骤的沉淀；9-凝胶过滤精制后，不含还原剂。实施例下面通过优选实验对本专利技术做更详细的描述。实施例一、复合干扰素表达载体构建根据文献报道的Amgen公司的复合干扰素的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，并考虑克隆、鉴定的方便性，设计了编码复合干扰素的DNA序列如下ATG TGT GAT TTA CCT CAA ACT CAT TCT CTT GGT AAC CGT CGC GCT CTG ATTCTG CTG GCA CAG ATG CGT CGT ATT TCC CCG TTT AGC TGC CTG AAA GAC CGT CACGAC TTC GGC TTT CCG CAA GM GAA TTC GAT GGC AAC CAA TTC CAG MA GCT CAGGCA ATC TCT GTA CTG CAC GAA ATG ATC CAA CAG ACC TTC AAC CTG TTT TCC ACTMA GAC AGC TCT GCT GCT TGG GAC GM AGC TTG CTG GAG AAG TTC TAC ACC GAGCTG TAT CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCA TGC GTA ATC CAG GAA GTT GGT GTAGM GAG ACT CCG CTG ATG AAC GTC GAC TCT ATT CTG GCA GTT AAA AAG TACTTCCAG CGT ATC ACT CTG TAC CTG ACC GAA AAG AAA TAT TCT CCG TGC GCT TGG GAAGTA GTT CGC GCT GAA ATT ATG CGT TCT TTC TCT CTG AGC ACT MC CTG CAG GAGCGTCTGCGCCGTAAAGAATAATAG根据上述设计的DNA序列，分别合成两组寡聚核苷酸片段，每组12个， 长度在40个碱基左右。每组中的12个片段依次重叠，两组分别室温退火，利用 T4DNA连接酶使形成两条双连DNA。此两段DNA末端含有HindIII粘性末端，经电泳纯化后，等比例混合，利用连接酶使之形成一条完整的双链DNA。利用上游引物 ATATAGCTTAAG CTAGAAACCATGAGGGTAATAAATA TAATGTGTGATTTACCTCAA 和下游引物 ATATAGTCTAGACTATTATTCTTTACGGC,用 PCR 方法扩增上述 DNA 片段，在 5 ‘端引入 AflII 酶切位点(CTTAAG)和核糖体结合位点序列(引物中斜体表示部分)；在3'端引入)(ba I酶切位点(TCTAGA)。PCR产物经AflII和)(baI双酶切后，克隆到表达载体pTac中，命名为 pTac-CI。经过定点突变和活性筛选，得到高活性的重组复合干扰素，序列为SEQ1，突变分别是已有复合干扰素序列中115位Val — Glu和122位Lys — Argo实施例二、在大肠杆菌中表达复合干扰素表达载体pTac-CI转化于大肠杆菌BL-21，并把转化的大肠杆菌在2008年2月27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。保藏号CGMCCN0. 2379。从划线培养的菌板挑取单菌落，接种于100毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基，370C 培养，发酵罐转速300rpm，氧饱和度20% -60%, ρΗ7· 0-7.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型重组复合干扰素，其特征是具有ＳＥＱ１序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，
申请(专利权)人：王琳，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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