一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种检测去甲氯胺酮（ＮＫＥＴ）的ＥＬＩＳＡ测试盒及制备方法。测试盒包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液、包被板、去甲氯胺酮（ＮＫＥＴ）标准品、抗ＮＫＥＴ单克隆抗体和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。包被板包被固相抗原，去甲氯胺酮标准品从去甲氯胺酮纯品中稀释得到，抗ＮＫＥＴ单克隆抗体通过先制备去甲氯胺酮的完全抗原，利用小鼠免疫制得。本发明专利技术提供的去甲氯胺酮（ＮＫＥＴ）的ＥＬＩＳＡ测试盒采用酶联免疫吸附检测方法，通过测定去甲氯胺酮的吸光度值，从标准曲线计算样品中的ＮＫＥＴ含量。操作简便，检测快速、灵敏、准确，专用测试盒使用方便、价格低，适用于大批量样品的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及违禁药品的检测，属于生物
，具体为一种去甲氯胺酮(NKET)的酶联免疫分析用测试盒及制备方法。
技术介绍
氯胺酮(Ketamine)，在我国俗称“K粉”，化学名为2-邻氯苯基-2-甲胺基-环己酮。试图以其替代苯环己哌啶(PCP)，消除PCP作为麻醉剂所产生的精神性副作用，而成为一种新型麻醉剂。氯胺酮是PCP的衍生物，于1962年首次人工合成，属非麻醉性镇痛药类。该药物在亚麻醉剂量时就能深度镇痛，而且没有大多数其它常规麻醉剂相关的抑制心脏、呼吸功能的副作用，已经在临床试用多年。 自1971年美国旧金山和洛杉矶市首先报告的氯胺酮滥用病例以来，氯胺酮滥用迅速蔓延至周边国家。上个世纪90年代末，氯胺酮滥用流入日本，泰国等亚洲国家，并迅速蔓延到我国。近二十年来，我国滥用氯胺酮的比例连续攀升，香港特别行政区尤为严重。鉴于氯胺酮滥用全球化的严重性，建立准确、灵敏的检测方法十分必要。 氯胺酮代谢较快，最初分布在脑和其他高灌流组织，然后分布到低灌流区。氯胺酮代谢的半衰期为3～4h，借助于细胞色素酶P450经N去甲基作用形成能产生与氯胺酮相同效果的去甲氯胺酮(norket本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测去甲氯胺酮（ＮＫＥＴ）的ＥＬＩＳＡ测试盒，其包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液，其特征在于：其还包括包被板、去甲氯胺酮（ＮＫＥＴ）标准品、抗ＮＫＥＴ单克隆抗体和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。

【技术特征摘要】
1、一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于其还包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)标准品、抗NKET单克隆抗体和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。2、一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒的制备其特征在于其包括以下步骤，包被板的制备、去甲氯胺酮(NKET)标准品的制备、抗NKET单克隆抗体的制备和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。3、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备其特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L pH9～10Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀释至0.1μg/m L～1.0μg/m L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH 7～8的磷酸盐缓冲液，2～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20～-40℃冷冻保存；4、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备其特征在于所述去甲氯胺酮标准品从去甲氯胺酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，NKET浓度为0ng/mL～100ng/mL。5、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备其特征在于，所述抗NKET单克隆抗体的制备50μgNKET-BSA偶联抗原用50μl生理盐水配成1μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂(液体石蜡∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混匀，充分乳化，供首次免疫用。加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂(液体石蜡∶羊毛脂＝12g∶20m1)代替完全福氏佐剂。首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为50μg/只小鼠。以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只。最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合。将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10∶1比例混合。离心，去除上清。在50～90S内将1ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1min后加入20ml DEM培养液，终止融合。水浴静止10min后离心，去除上清。将融合细胞用含20％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％CO2，37℃条件下培养，8d后，每培养孔更换2/3HT培养液。10d～20d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆。杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行。以NKET-OVA为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照。阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)＞2.1。对分泌阳性抗体的细胞进行克隆。采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。对10～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只。5d后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。6、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备其特征在于，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓联，赵春城，杨婷婷，沈笑平，魏万里，何金海，蔡建荣，龚燕，蔡正森，吴杰，沈雯琰，王文静，张海涛，
申请(专利权)人：江苏省苏微微生物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]