【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及发酵工程，尤其涉及一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用。
技术介绍
1、四氢嘧啶，又称依克多因，是一种氨基酸衍生物，属于极端酶组分。最新研究发现，在极端条件下，如高盐、高温和高紫外线辐射下，四氢嘧啶能有效保护嗜盐菌免受伤害。同时，研究证明四氢嘧啶对皮肤具有良好的修复保护作用，因此在保健、生命科学和化妆品行业得到广泛应用。在有机合成中，四氢嘧啶促进酯化、缩合、烷基化等反应。在聚合物工业中，作为聚氨酯、聚丙烯酰胺等高分子材料的溶剂和反应介质。在药物制备中，作为溶剂有助于药物反应和结晶。四氢嘧啶还被广泛应用为通用有机溶剂，用于溶解和处理各种有机化合物，以及在实验室技术中的使用。
2、生产上，四氢嘧啶的制备大都通过化学合成的方式实现，制备方法始于丙烯，经过氧化、缩合、脱水和脱氧等步骤生成最终产品。然而，传统制备方法存在一些弊端，包括反应条件苛刻、催化剂复杂以及中间产物毒性。同时，传统制备方法依赖非可再生的石油化工原料，不符合可持续发展要求，因此迫切需要环保、高效的新技术路径。
3、微生物发酵法已经被作为大多数天然小分子产物大规模生产的主流方式，因此，构建一株遗传背景清晰、产量较为可观的四氢嘧啶生产菌株是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为了解决上述背景所提出的技术问题，本专利技术提供一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用，通过对e.coli、bacillus subtilis和halomonasvenusta的糖酵解、天冬
2、为达到上述的设计目的，本专利技术采取的技术方案如下：
3、本专利技术的一个目的是提供了一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，该菌种为e.coli-ect09，以野生型e.coli.w3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得。
4、进一步地，野生型e.coli.w3110的保藏号为atcc 273250。
5、本专利技术的另一个目的是提供一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，该系统包括：
6、(1)通过在e.coliw3110的基因组ycgh、yghx、yciq点引入经人工密码子优化的异源二氨基丁酸乙酰转移酶基因ecta、丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectb、四氢嘧啶合酶基因jds37_rs09010，均由ptrc启动子启动。
7、(2)通过在基因组mbha位点引入经人工密码子优化的异源丙酮酸羧化酶基因pycaptrc启动子启动。
8、(3)通过在基因组ycdn、yeel、yeep位点分别过表达内源天冬氨酸转氨酶基因aspc、天冬氨酸激酶基因lysc、天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd，均由ptrc强启动子启动。
9、(4)将双功能天冬氨酸激酶基因thra的天然启动子换为pj23114启动子；将二氢吡啶甲酸合酶基因dapa的天然启动子换为pj23114启动子。
10、进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述经人工密码子优化整合的异源二氨基丁酸乙酰转移酶基因ecta、丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectb、四氢嘧啶合酶基因jds37_rs09010均来自于美丽盐单胞菌halomonas venusta(atcc 27125),其中,所述二氨基丁酸乙酰转移酶基因ecta的核苷酸序列如seq id no.1所示(ecta；ncbi-geneid:77015291)；所述丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectb核苷酸序列如seq id no.2所示(ectb；ncbi-geneid:77015290)；所述四氢嘧啶合酶基因jds37_rs09010核苷酸序列如seq id no.3所示(jds37_rs09010；ncbi-geneid:77015289)。
11、更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述经人工密码子优化的丙酮酸羧化酶基因pyca来自于枯草芽孢杆菌b.subtilis 168(atcc 23857)，其中所述丙酮酸羧化酶基因pyca的核苷酸序列如seq id no.4所示(pyca；ncbi-geneid:935920)。
12、更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述天冬氨酸转氨酶基因aspc的核苷酸序列如seq id no.5所示(aspc；ncbi-geneid:945553)；所述天冬氨酸激酶基因lysc的核苷酸序列如seq id no.6所示(lysc；ncbi-geneid:948531)；所述天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd的核苷酸序列如seq id no.7所示(lysc；ncbi-geneid:948531)；所述双功能天冬氨酸激酶基因thra的核苷酸序列如seq id no.8所示(thra；ncbi-geneid:948531)；所述二氢吡啶甲酸合酶基因dapa的核苷酸序列如seq id no.9所示(dapa；ncbi-geneid:946952)。
13、更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述ptrc启动子的核苷酸序列如seq id no.10所示；pj23114启动子的核苷酸序列如seq id no.11所示。
14、本专利技术的又一目的是提供基因工程菌e.coli-ect09在发酵生产四氢嘧啶中的应用。
15、利用基因工程菌e.coli-ect09发酵生产四氢嘧啶的方法，发酵方法包括以下步骤：
16、(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：36℃；
17、(2)种子培养：培养过程ph维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在35％-50％，培养至od为20时转接发酵罐中进行发酵培养；
18、(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵ph维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节ph。
19、进一步地，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉6g/l，蛋白胨4g/l，柠檬酸1g/l，(nh4)2so43g/l，mgso4·7h2o 0.4g/l，kh2po41.5g/l，feso4·7h2o10mg/l，mnso45mg/l，vb1、vb3、vb5、vb 12各2mg/l，vh 1mg/l，其余为水。
20、进一步地，采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉6g/l，蛋白胨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，该菌种为E.coli-ect09，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得。
2.根据权利要求1所述的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，野生型E.coli.W3110的保藏号为ATCC 273250。
3.根据权利要求1或2所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
6.利用权利要求3制备的基因工程菌E.coli-ect09在发酵生产四氢嘧啶中的应用。
7.利用权利要求3制备的基因工程菌E.coli-ect09发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，发酵方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤202中
9.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤203中采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，氨基酸混合粉2g/L,(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO44g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L。
10.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤203的培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
...【技术特征摘要】
1.一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，该菌种为e.coli-ect09，以野生型e.coli.w3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得。
2.根据权利要求1所述的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，野生型e.coli.w3110的保藏号为atcc 273250。
3.根据权利要求1或2所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
6.利用权利要求3制备的基因工程菌e.coli-ect09在发酵生产四氢嘧啶中的应用。
7.利用权利要求3制备的基因工程菌e.coli-ect09发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，发酵方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁峰，
申请(专利权)人：台州市益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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