【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种细胞线粒体自噬的检测方法及其应用。
技术介绍
1、线粒体自噬(mitophagy)是细胞选择性清除损伤线粒体以调节胞内线粒体数量和维持线粒体稳态的一种动态生理平衡过程。线粒体自噬的机制包括泛素依赖、受体依赖和心磷脂依赖等，但不管是何种机制的线粒体自噬，其最终都需要将受损线粒体与自噬体融合，选择性地隔离在自噬体的双膜囊泡内，之后这些自噬体再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将受损线粒体进行降解。
2、目前研究线粒体自噬的方法包括透射电镜技术、荧光技术，其中荧光技术包括自噬相关蛋白免疫荧光技术、荧光探针标记技术、荧光标记基因转染技术。
3、透射电镜技术利用的是线粒体自噬早期形成的线粒体与自噬体的结合物可以通过线粒体特有的双层膜、嵴等特征辨别，而其与溶酶体融合形成的线粒体自噬溶酶体仅能通过单层膜或消化后的残留物来大体识别，导致获得的结果存在很大的变数，如因切片等人为因素造成的膜结构的改变，其他双层膜细胞器的干扰或者低电子密度空泡的误导等。因此，常规的透射电镜观察方法仅能对完整的线粒体自噬体进行观察，由于选取细胞数量有限，无法反映自噬活性，在定量分析中存在不足，而且检测过程繁琐且周期较长。
4、自噬相关蛋白免疫荧光技术利用了抗原抗体反应原理，然而抗体效价要求较高，实验周期长，过程繁琐，不能检测线粒体自噬的动态过程，且只能观察到线粒体与自噬体结合，不能分辨处于自噬溶酶体吞噬阶段的线粒体。
5、荧光探针标记技术利用线粒体和溶酶体特异性染色技术对线粒体自噬进行检测，但只
6、目前使用的荧光标记基因转染技术，第一种是将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与天然荧光蛋白基因连接起来构成融合基因，导入细胞内表达，随后进行细胞内活体跟踪，但是只能观察到线粒体与自噬体结合，不能分辨处于自噬溶酶体吞噬阶段的线粒体。
7、第二种是利用将线粒体特异性蛋白的基因与ph敏感的天然荧光蛋白基因连接构成融合基因，导入细胞内表达，当受损线粒体进入溶酶体中时，利用溶酶体中的酸性环境，使荧光发生变化，对线粒体自噬进行检测，以此确定线粒体与自噬溶酶体的共定位。由于自噬体也呈中性，所以当受损线粒体被自噬体包裹后，不会引发颜色改变，所以不能识别此阶段，只能识别被自噬溶酶体吞噬阶段的线粒体。
8、因此，需要开发一种细胞线粒体自噬的检测方法，能够检测全阶段的线粒体自噬。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种细胞线粒体自噬的检测方法及其应用，改善现有技术中存在的定量分析中存在不足、只能识别部分线粒体自噬阶段而不能检测到线粒体自噬全过程等问题。
2、本专利技术提供一种细胞线粒体自噬的检测方法，包括以下步骤：
3、s 1、将腺病毒感染后的细胞使用线粒体荧光探针进行标记；所述腺病毒包括mrfp-gfp-lc3；所述线粒体荧光探针包括mito-tracker deep red fm；
4、s2、所述标记完成后，使用显微镜观察线粒体自噬进程。
5、可选地，线粒体荧光探针mito-trackerdeep red fm含有的弱巯基反应性的氯甲基，可以和线粒体内蛋白的巯基反应并共价连接，从而标记线粒体。
6、可选地，腺病毒mrfp-gfp-lc3中荧光蛋白mrfp和荧光蛋白gfp的荧光颜色不同，荧光蛋白mrfp为红色，荧光蛋白gfp为绿色，将mrfp与gfp荧光蛋白基因与自噬体特异性基因lc3串联后构成融合基因，导入细胞中表达，此时可检测到红、绿两色的叠加，即黄色荧光，用以指示自噬体；当自噬体与溶酶体结合后，荧光蛋白gfp对酸性敏感，此时gfp荧光发生淬灭，只显示mrfp的红色荧光，用于指示及追踪自噬溶酶体。
7、可选地，步骤s1中所述腺病毒感染步骤中细胞汇合度为35-45％。
8、可选地，步骤s2中所述显微镜包括荧光显微镜和共聚焦显微镜。
9、可选地，步骤s2中所述使用显微镜观察线粒体自噬进程步骤中包括：
10、在不同波长下进行荧光信号的检测，并将不同颜色荧光信号的图像进行合并，得到合并图像；
11、通过所述合并图像中不同颜色的荧光信号的共定位情况观察线粒体自噬的进程。
12、可选地，所述不同颜色的荧光信号包括蓝色荧光、红色荧光、绿色荧光。
13、可选地，所述蓝色荧光在伪彩色条件下获取，以区分于红色荧光信号、绿色荧光信号。
14、第二方面，本专利技术提供一种所述方法在检测线粒体自噬动态过程中的应用。
15、第三方面，本专利技术提供一种所述方法在检测线粒体自噬程度与疾病的发展关系中的应用。
16、具体的，所述线粒体自噬程度与疾病的发展关系可通过计算不同颜色的荧光信号共定位数量或面积进行检测。
17、本专利技术具备的有益效果包括：
18、(1)本专利技术提供的检测方法，通过使用荧光标记基因转染技术将mrfp-gfp-lc3串联双荧光蛋白腺病毒转染至细胞内稳定表达后，使用线粒体荧光染料来特异性标记线粒体，标记完成后能够响应于局部环境变化而改变荧光强度，只观察不同颜色的共定位情况，就可同时监测线粒体及其自噬情况。
19、(2)本专利技术提供的检测方法，能够实时监测全阶段的线粒体自噬过程，包括自噬体和自噬溶酶体，可应用于判断细胞是否发生线粒体自噬以及观测线粒体自噬的进程。
20、(3)本专利技术提供的检测方法为观察线粒体自噬的研究提供了更加快速、便利、准确的策略，系统直观清晰的指示了细胞线粒体自噬的水平，是对研究线粒体自噬方法学的补充。
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1.一种细胞线粒体自噬的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述腺病毒感染步骤中细胞汇合度为35-45％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述显微镜包括荧光显微镜和共聚焦显微镜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述使用显微镜观察线粒体自噬进程步骤中包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述不同颜色的荧光信号包括蓝色荧光、红色荧光、绿色荧光。
6.如权利要求1所述的方法在检测线粒体自噬动态过程中的应用。
7.如权利要求1所述的方法在检测线粒体自噬程度与疾病的发展关系中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种细胞线粒体自噬的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述腺病毒感染步骤中细胞汇合度为35-45％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中所述显微镜包括荧光显微镜和共聚焦显微镜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄起壬，陈胜，熊小伟，黄倩倩，刘琛，刘文涛，汪媛，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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