【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，尤其涉及一种柽柳的遗传转化方法。
技术介绍
1、柽柳(tamarix chinensis lour.)为柽柳科、柽柳属多年生灌木或小乔木植物，具有耐盐碱、耐高温寒冷的优良特性，能适应干旱沙漠和在滨海盐土生存，是防风固沙、改造盐碱地、绿化环境的优良树种之一，也是优良抗逆植物资源。
2、对植物的抗逆基因功能以及机制的研究需要建立高效、稳定的遗传转化体系，现有技术中也提供了一些柽柳的遗传转化方法，例如，专利cn115094083a提供了一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法，该方法以柽柳组培苗的茎段基部组织为外植体进行侵染转化。然而，专利技术人在实验中发现，目前建立的遗传转化方法在转化后基因的表达稳定性随时间延长而减弱，基因整合的成功率较低。
3、因此，目前针对柽柳急需构建一种提高基因整合成功率以及表达稳定性的遗传转化体系和方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术旨在提供一种柽柳的遗传转化方法，包括如下步骤：
2、步骤一、取柽柳叶片的顶端分生组织，诱导其形成丛生芽，以所述丛生芽作为转化受体；
3、步骤二、用农杆菌对步骤一获得的转化受体进行侵染，共培养；
4、步骤三、对步骤二共培养后的转化受体进行分化筛选培养和生根培养。
5、在一种实施方式中，步骤一中所述诱导的步骤在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：wpm培养基，0.5mg/l 6-ba，1mg/l kt，30g/
6、在一种实施方式中，所述诱导的条件为：25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
7、在一种实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌
8、在一种实施方式中，所述农杆菌中含有表达目的基因的重组载体。
9、可选的，所述目的基因为筛选标记基因，例如荧光标记基因。
10、在一种实施方式中，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～2mpa条件下抽真空5～20min，20khz～30khz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～2mpa条件下抽真空5～20min。
11、优选的，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.1mpa条件下抽真空10min，20khz下超声振荡5min，再于0.1mpa条件下抽真空10min。
12、在一种实施方式中，所述农杆菌侵染液的od600值为0.2～0.5。
13、在一种实施方式中，步骤二中所述共培养的方法包括：取出转化受体置于共培养培养基中，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天，转为光培；
14、在一种实施方式中，所述共培养培养基包括：wpm培养基，0.5mg/l 6-ba，1mg/lkt，30g/l蔗糖，3.8g/l phyto，200um/l as。
15、在一种实施方式中，步骤三中所述分化筛选培养的步骤在分化培养基中进行，所述分化培养基包括：wpm培养基，0.5mg/l 6-ba，1mg/l kt，30g/l蔗糖，3.8g/l phyto。
16、在一种实施方式中，所述分化培养的条件包括：22℃～26℃、4000lux光照条件下，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
17、在一种实施方式中，本申请采用的培养基ph均为5.90～6.00，优选为5.95。
18、在一种实施方式中，所述方法还包括获得阳性芽后继续扩繁的步骤，所述扩繁包括生根培养。
19、可选的，所述生根培养可采用现有的柽柳生根培养基以及培养条件。
20、另一方面，本申请还提供了所述的方法在提高柽柳遗传转化中目的基因表达稳定性中的应用。
21、在一种实施方式中，所述目的基因包括gfp基因和ruby基因。
22、与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：
23、本申请设计并成功构建了柽柳的遗传转化方法，在本申请提供的方法中，采用柽柳叶片顶端分生组织诱导形成的丛生芽作为转化受体，并对叶片尤其是顶端分生组织诱导形成丛生芽的诱导培养条件进行了优化，柽柳叶片在优化的诱导培养条件下形成的丛生芽具有很强的分裂分化能力，相较于叶片、组培苗等其他外植体，其在转化后的基因整合成功率明显提高，并且显著改善了转化基因表达的稳定性。
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1.一种柽柳的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述诱导的步骤在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：WPM培养基，0.5mg/L 6-BA，1mg/L KT，30g/L蔗糖，3.8g/Lphyto；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～2MPa条件下抽真空5～20min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的OD600值为0.2～0.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述共培养的方法包括：取出转化受体置于共培养培养基中，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天，转为光培；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述分化筛选培养的步骤在分化培
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括获得阳性芽后继续扩繁的步骤，所述扩繁包括生根培养。
9.如权利要求1-8任一所述的方法在提高柽柳遗传转化中目的基因表达稳定性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的基因包括GFP基因和Ruby基因。
...【技术特征摘要】
1.一种柽柳的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述诱导的步骤在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：wpm培养基，0.5mg/l 6-ba，1mg/l kt，30g/l蔗糖，3.8g/lphyto；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～2mpa条件下抽真空5～20min，20khz～30khz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～2mpa条件下抽真空5～20min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的od600值为0...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文杰，付春祥，赵海霞，王广耀，姜希萍，
申请(专利权)人：青岛文盛元农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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