【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及提高植物中维生素d和/或维生素d原水平的方法。本专利技术还涉及通过该方法获得的植物及其果实，以及由本专利技术的植物制备的食物产品。
技术介绍
1、维生素d因其能够预防影响骨骼发育的缺乏性疾病，特别是儿童佝偻病、成人骨软化症和骨质疏松症而被鉴定的1。维生素d通过两个羟基化反应转化为具有类固醇激素生物活性的产物，其不仅在钙稳态中起作用，而且在包括心脏、骨骼、肺、肠、乳腺和大脑在内的多个器官中起信号传导作用2。因此，维生素d缺乏会影响免疫功能和炎症，并与癌症(特别是乳腺癌和结肠癌3,4)、帕金森病5、抑郁症6、神经认知下降7、痴呆8的风险增加，以及与最近新型冠状病毒感染的严重程度9有关。在皮肤暴露于uv-b光后，人类可以从7-脱氢胆固醇(7-dhc)合成维生素d10，但主要来源是饮食11。据估计，全世界约有10亿人患有维生素d不足12，而且由于膳食供应不足，这一数字还在大量增加。在所有年龄段，维生素d状况不佳是一个主要的公共卫生问题。欧洲食品安全局(european food safety authority)规定，一岁以上的健康人每天摄入15μg，而在美国，美国国立卫生研究院(national institutes ofhealth)建议儿童和成年人每天摄入15μg，70岁以上的成年人每天摄入20μg。一般来说，如果不通过强化食品或维生素d补充剂补充，这些摄入量就无法从食物来源获得。因为人类在暴露于uv-b照射后可以从7-dhc中自行合成维生素d3，所以大多数纠正维生素d3不足的建议都是基于增加阳光暴露。然而，即使在充
2、虽然维生素d2最初是在植物中发现的，但最终证明这是由于真菌感染13。维生素d3原(7-dhc)由一些植物合成，如番茄，主要在叶片中合成胆固醇和甾体糖生物碱(sga)。番茄叶片的uv-b暴露产生维生素d3，但通常认为植物是相对较差的饮食来源，最好的来源是鱼和乳制品。暴露于uv-b光后，蘑菇和酵母可以作为维生素d2的来源，但据一些流行病学研究报道，维生素d2的生物有效性明显低于维生素d314,15。素食主义的日益普及意味着，在没有额外补充的情况下(这需要从蘑菇中获取维生素d2)，越来越多的饮食可能缺乏维生素d。
3、为植物提供更高水平的维生素d和/或维生素d原将是有益的。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、我们利用茄科植物中植物甾醇生物合成途径的部分重复，通过基因组编辑设计了维生素d3原在番茄中的积累，为生物强化食品提供了利用废料生产补充剂的选择。
2、在本专利技术的第一方面中，提供了一种提高植物中维生素d3原水平的方法，该方法包括降低植物中7-脱氢胆固醇还原酶(7-dr)的活性。在优选实施方案中，植物是具有7-dr基因重复的植物；在此，优选其中一个基因座被靶向用于降低活性。如本文所述，7-dr2酶将维生素d3原/7-dhc转化为胆固醇，用于在番茄植物的叶子和果实中合成番茄碱。因此，抑制番茄中7-dr2的活性可以导致7-dhc的积累，而不会对植物甾醇和油菜素类甾醇的生物合成产生任何影响。该基因和酶在本文中称为si7-dr2(即番茄特异性基因)，尽管可以理解为这旨在涵盖其他植物物种的同源物和直向同源物。
3、“降低活性”可能意味着降低或消除酶的活性或表达。在优选实施方案中，该方法包括将功能丧失突变引入7-dr基因(优选si7-dr2基因)的至少一个拷贝中。突变可能在编码序列中。突变可能是插入，缺失或改变。在实施方案中，可以将功能丧失突变引入si7-dr2基因的多个拷贝中。优选地，通过基因组编辑引入突变，优选zfn、talen或crispr。在一些实施方案中，诱变剂(例如辐射)可用于引入突变。在一些实施方案中，突变可以被引入基因的至少一个拷贝中，并且常规育种技术用于产生基因组中具有多个突变的植物，例如纯合植物。
4、在其他实施方案中，转录后技术可用于降低或消除酶活性。例如，rnai、crispri或反义技术均可用于降低酶水平。该方法可包括将sirna或反义分子引入植物中；或者可以包括将编码sirna或反义分子的核酸序列引入植物中。这种核酸序列可以稳定地掺入植物基因组中。
5、如果酶活性降低(但未消除)，则与野生型或对照植物中的水平相比，活性优选降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。确定酶活性的方法在技术人员的专业知识范围内。
6、在实施方案中，与野生型或对照植物中的水平相比，植物中7-dhc的水平增加了至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。
7、该方法还可以包括将植物或植物的一部分暴露于uvb辐射。这种暴露的时间和强度优选足以将植物中存在的至少一些7-dhc转化为维生素d3。在这样的实施方案中，与野生型或对照植物中的水平相比，维生素d3的水平增加了至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。
8、在一些实施方案中，植物还携带可增加uv-b光对果实的穿透的突变。例如，番茄的y突变会导致“粉红番茄”皮肤中紫外线防护黄酮醇的损失，从而允许进一步穿透。该方法可以包括将这种突变引入本专利技术的植物中；这可以通过常规育种技术或通过靶向基因组编辑来实现。在其他实施方案中，本专利技术的方法可应用于已经携带这种突变的植物；也就是说，突变体植物被用作降低si7-dr2活性的背景。
9、在一个实施方案中，植物还携带一个或多个影响成熟果实中叶绿素分解的突变。一个实例是番茄staygreen基因座的突变。这种突变可能有助于进一步提高成熟果实中7-dhc的水平。这些性状的堆叠可以通过使用zfn、talen或crispr进行基因组编辑或通过基因渗入来实现。
10、在一个实施方案中，该方法还包括处理植物或植物的一部分以获得7-dhc和/或维生素d3。当植物的部分通常不被消费时，例如，番茄收获后的叶子或茎，这样的实施方案可能特别有用。
11、在本专利技术的另一方面中，提供了一种遗传改变的植物、其部分或植物细胞，其中该植物、其部分或植物细胞具有降低的7-脱氢胆固醇还原酶活性。植物、其部分或植物细胞可包含7-dr基因(优选si7-dr2基因)中的功能丧失突变。
12、植物部分可以是种子、果实、根、块茎、叶、花。
13、在上述每个方面中，植物优选是茄科(solanaceae)，更优选茄属物种(solanumspp)的成员。植物可以选自番茄(solanum lycopersicum)、马本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.提高植物中维生素D3原水平的方法，所述方法包括降低植物中7-脱氢胆固醇还原酶(7-DR)的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括引入一个或多个降低植物中由7-DR基因编码的酶的活性的突变。
3.根据权利要求2所述的方法，其中植物基因组包含7-DR基因的重复，并且将一个或多个突变引入7-DR2基因。
4.根据权利要求2或3所述的方法，还包括培育突变植物以获得突变纯合的植物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中转录后技术用于降低或消除酶活性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括将植物或植物的一部分暴露于UV-B辐射。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物携带增加UV-B光对果实的穿透的突变。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括处理植物或植物的一部分以获得7-DHC和/或维生素D3。
9.基因改变的植物、其部分或植物细胞，其中所述植物、其部分或植物细胞具有降低的7-脱氢胆固醇还原酶活性。
10.根据权利要求9所述的
11.根据权利要求10所述的植物、其部分或植物细胞，其中所述功能丧失突变位于7-DR2基因中。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，或根据权利要求9至11中任一项所述的植物、其部分或植物细胞，其中所述植物是茄科(Solanaceae)，更优选茄属物种(Solanumspp)，最优选选自番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)中的成员。
13.由权利要求9至11中任一项所述的植物或植物部分生产的食物产品。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.提高植物中维生素d3原水平的方法，所述方法包括降低植物中7-脱氢胆固醇还原酶(7-dr)的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括引入一个或多个降低植物中由7-dr基因编码的酶的活性的突变。
3.根据权利要求2所述的方法，其中植物基因组包含7-dr基因的重复，并且将一个或多个突变引入7-dr2基因。
4.根据权利要求2或3所述的方法，还包括培育突变植物以获得突变纯合的植物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中转录后技术用于降低或消除酶活性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括将植物或植物的一部分暴露于uv-b辐射。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物携带增加uv-b光对果实的穿透的突变。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括处理植物或植物的一部分...
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