【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种活化神经小胶质细胞的药用真菌泰山灵芝外泌体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、灵芝是一种药食两用真菌，在我国有着悠久的应用历史。其主要活性成分包括三萜类化合物、灵芝多糖、生物碱、蛋白质、核苷和微量元素等。研究表明，灵芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、保肝等功效。灵芝被广泛应用于保健食品、药品、化妆品等领域，深受广大消费者的喜爱。泰山灵芝是泰山独有的灵芝品种，富含蛋白质、氨基酸、核苷酸等营养成分和多糖、灵芝酸、麦角甾醇、香豆精等多种生理活性物质，食药用价值极高。
2、外泌体(exosomes)是由细胞分泌直径40～100 nm的纳米级囊泡状结构,本质为一种脂质双分子囊泡,其主要组成部分及内容物为蛋白质、核酸、脂质等生物活性分子。不管在生理还是病理状态下，外泌体可由绝大多数细胞持续分泌，并且存在于几乎所有体液中，是信息交流和物质交换的重要方式。目前外泌体来源多为动物源性，目前还没有针对菌源性外泌体提取方法。
3、脑卒中是世界范围内死亡率和致残率较高的脑血管疾病之一，包括缺血性卒中和出血性卒中。其中，缺血性卒中占脑卒中总数60%-70%。脑缺血再灌注(i/r)可引发细胞死亡、氧化应激、炎症等一系列细胞反应。炎症在i/r损伤的发病机制中起着至关重要的作用。小胶质细胞作为中枢神经系统中主要的常驻免疫细胞，通过介导炎症反应在维持中枢神经系统稳态中发挥关键作用。在微环境变化的作用下，小胶质细胞可以被激活为促炎表型(m1)或抗炎表型(m2)。当脑损伤时，小胶质细胞向m1表型激活，并释放
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术在提供了一种活化神经小胶质细胞的药用真菌泰山灵芝外泌体的制备方法。
2、本专利技术进一步的提供了一种上述药用真菌泰山灵芝外泌体对缺糖缺氧损伤的活化小胶质细胞的修复作用，为菌源性外泌体治疗脑卒中损伤提供了一种新的治疗思路。
3、本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
4、本专利技术提供了一种药用真菌泰山灵芝外泌体的制备方法，包括以下步骤：
5、（1）将灵芝活化母种接种于pda固体培养基中，倒置培养，待菌丝长满平皿，挑取菌丝接种到液体发酵培养基中，进行摇床培养得到种子培养基；
6、（2）将种子培养基在液体发酵培养基中继续摇床培养，得灵芝发酵液；
7、（3）将灵芝发酵液通过无菌纱布过滤，梯度离心后再进行超高速离心，收集沉淀，最终得到灵芝菌外泌体，用pbs重悬沉淀，放在冰箱-80℃保存。
8、本专利技术所使用的pda固体培养基的制备过程为：
9、（a）在1l超纯水中加入马铃薯200g，煮沸40min后，用八层纱布过滤，弃滤渣，在滤液中加入3g kh2po4、1.5g mg2so4·7h2o、20g葡萄糖、10mg维生素b1、20g琼脂、3g棉子糖、0.5g甜菜碱；
10、（b）在溶解均匀后倒入锥形瓶内，每个锥形瓶装液量150ml，后115℃，灭菌30min；灭菌后待温度降至50-60℃，倒入无菌的直径90mm的培养皿内，倒入厚度为2-3cm，待培养基凝固后即可。
11、进一步的，步骤（1）中，所述倒置培养为在25℃的温度下倒置培养7d；所述摇床培养为在25℃、140rpm条件下培养3d。
12、进一步的，步骤（2）中，所述摇床培养为摇床转速140r/min，培养温度25℃，摇瓶培养2-3d。
13、进一步的，步骤（3）中，所述梯度离心的程序为：2000g，15min、10000g，40min、15000g，40min；所述超高速离心为110000g，1h 35min。
14、本专利技术还提供了一种利用上述制备方法制备得到的药用真菌泰山灵芝外泌体在活化及修复缺糖缺氧损伤的神经小胶质细胞中的应用。
15、本专利技术得到的灵芝外泌体，用透射电镜观察该外泌体的形态为圆形或椭圆形的茶托状结构。zeta电位分析仪测定灵芝外泌体粒径大部分分布在50-100nm之间，符合外泌体的粒径范围。
16、本专利技术所解决的第三个技术问题是提供通过本专利技术方法制备所得的外泌体在活化神经小胶质细胞方面的用途：即本专利技术方法所得的外泌体对于缺糖缺氧损伤的小胶质细胞具有修复作用。
17、该用途的具体步骤如下：
18、一、灵芝外泌体可以进入bv2细胞中发挥作用。利用dio染料标记提取的灵芝外泌体，然后加入到bv2细胞中进行共培养，在共培养4h后，利用多聚甲醛固定液固定细胞后。利用dapi染液标记细胞核，随后用双光子显微镜观察，发现绿色荧光大量分布在细胞核周围，即细胞质内，说明灵芝外泌体能够进入bv2细胞中发挥作用。
19、二、用cck-8法检测细胞存活率，方法包括如下步骤：
20、1、用bca蛋白定量分析法测定所提取外泌体的浓度。
21、2、构建小胶质细胞缺糖缺氧损伤模型。
22、3、设置外泌体浓度梯度，将所提取的外泌体加入到缺糖缺氧后复糖复氧的小胶质细胞中，共孵育24小时后,cck-8法检测细胞存活率。结果分析表明灵芝外泌体对于缺糖缺氧损伤的小胶质细胞具有修复作用，且随着外泌体浓度增加，修复效果越好。
23、其中所述步骤1用bca试剂盒测定所提取外泌体浓度方法如下：1)蛋白标准溶液制备a 取出试剂盒中标签为蛋白标准配置液和蛋白标准（bsa）的1.5ml可立式离心管，从蛋白标准配置液中取出1ml液体，加入到标签名为蛋白标准（bsa）的1.5ml可立式离心管中，充分溶解。b将蛋白标准bsa溶液稀释成浓度为2mg/ml的蛋白标准（bsa）母液。注意在稀释时尽量保证蛋白标准溶液的稀释液与待测蛋白样品的溶剂相同。c将上步骤制备的浓度为2mg/ml的蛋白标准bsa母液稀释到试管中，同样注意稀释液尽量与待测蛋白样品的溶剂相同，稀释范围为0.025mg/ml-2mg/ml。2）bca工作液配置：按照试剂a和试剂b体积比50：1的比例，两种试剂充分混合均匀，现用现配。3）蛋白标准和样品蛋白浓度的测定：a取20ul上一步骤已稀释好的不同浓度蛋白标准溶液和蛋白待测样品依次加入到96孔酶标板中。b每孔加入200ulbca工作液，使用酶标仪震板功能震荡30s使溶液混匀。在37℃放置30min。c使用酶标仪测定562nm的吸光值。以蛋白标准的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性公式为y=0.6476x+0.0302（r2=0.9995）。测定样品稀释后，通过标准曲线计算出所提取外泌体中蛋白含量为0.28ug/ul。
24、其中所述步骤2 中构建小胶质细胞缺糖缺氧损伤模型。将各组细胞接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养24h。后将生长至60-70%的细胞，吸除原培养基，用无糖培养基清洗两次，将每孔更换为100ul的无糖培养基，置于三气培养箱中，按照培养箱内气体体积比为9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种药用真菌泰山灵芝外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述PDA固体培养基的制备过程为：
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述倒置培养为在25℃的温度下倒置培养7d；所述摇床培养为在25℃、140rpm条件下培养3d。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述摇床培养为摇床转速140r/min，培养温度25℃，摇瓶培养2-3d。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述梯度离心的程序为：2000g，15min、10000g，40min、15000g，40min；所述超高速离心为110000g，1h35min。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的药用真菌泰山灵芝外泌体在活化及修复缺糖缺氧损伤的神经小胶质细胞中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种药用真菌泰山灵芝外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述pda固体培养基的制备过程为：
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述倒置培养为在25℃的温度下倒置培养7d；所述摇床培养为在25℃、140rpm条件下培养3d。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述摇床培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨革，段天娇，车程川，刘金锋，巩志金，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：
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