魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，是以魔芋葡甘聚糖为主要基质，其制备方法是将魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，中和后加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱液充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。本发明专利技术所得蛋白质分子印迹膜，可作为生物分离模拟亲和膜应用于蛋白质分离纯化，尤其是基因工程蛋白质产品的分离纯化，生物传感检测中的敏感膜部件以模拟抗体识别相应抗原等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质分子印迹技术，尤其涉及魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜 及其制备方法和分离检测蛋白质的应用。
技术介绍
分子印迹技术是一种人工合成具有分子识别功能的介质的新技术。印迹分子与 合适的功能单体及交联剂混合使之相互作用并将其聚合，再用适当的方法将印迹的分子去 除，得到的聚合物即为分子印迹聚合物。印迹分子去除后留下的孔穴与印迹分子的形状、大 小、电荷分布具有互补性，因而这种聚合物具有选择性识别印迹分子的功能。分子印迹以其 良好的专一性和卓越的分子识别能力，成功地应用于高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳色 谱(CEC)和薄层色谱(TLC)的固定相、固相萃取(SPE)、药物分离、膜分离等领域。分子印迹 技术在各种小分子化合物的运用中取得成功后，现研究的重点和热点逐渐转移到蛋白质等 生物大分子的印迹上。以蛋白质为模板的分子印迹聚合物可以作为抗体、酶或其他天然生 物大分子的替代物、细胞支架材料、药物控释材料等，将分子印迹的应用领域进一步拓展到 蛋白质的分离、生物传感、免疫测定、模拟酶催化、模拟抗体、蛋白质药物的控制释放，以及 调节医疗器械表面的生物相容性等生物技术和医学领域。就蛋白质分子印迹方法而言，目前的研究报道较多，主要有蛋白质包埋法、表面 印迹法和抗原表位法等。由于蛋白质分子体积大，包埋法常存在模板分子难以去除的问题； 表面印迹法通过在聚合物如预制的硅石(二氧化硅)等表面上接枝或覆盖蛋白质印迹的聚 合物，能部分解决上述问题；也有利用金属螯合法，用结合有金属离子的载体螯合蛋白质的 印迹方法。此方法的缺陷是蛋白质表面必须有暴露的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱 氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基等，从而使其应用受到限制。另一种平板表面印迹法是将蛋白 质吸附在亲水的、分子级平坦的云母表面，然后将一个二糖类分子薄层覆盖在吸附的蛋白 质上。一经干燥，该糖层便通过大量的氢键与蛋白质络合。随后将一个平坦的含氟聚合物 薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而沉积。接着去除云母并溶解蛋白质，最终形成 一种多糖覆盖的、具有蛋白质形状的纳米凹坑。该方法表现出较好的选择性识别效果，但方 法较为复杂。抗原表位法以代表蛋白质结构中小的暴露片断的短肽作为模板进行印迹，则 所合成的印迹聚合物通过识别所印迹的短肽，来识别整个蛋白质分子，短肽价廉易得，这一 方法为高效合成对蛋白质具有高选择性的吸附剂和受体拓宽了思路，但只适用于暴露的片 断结构非常清楚的蛋白质的模板印迹和暴露的片断结构不同的蛋白质的分离，对尚不清楚 暴露结构的蛋白质显然是无能为力的。从方便蛋白质分子的洗脱和结合入手，分子印迹技 术由三维走向二维，各种分子印迹膜以及纳米线应运而生，其中以印迹膜制备方便受到广 泛青睐。近年来蛋白质分子印迹聚合物材料的研究报道也在不断增加。基于蛋白质的生物 活性和空间构象等特性，聚合中的单体、交联剂、引发方式以及识别体系均需要适应其生物 大分子的性质。目前采用的单体主要有丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、硅烷醇等，其中以丙烯酰胺为功能单体的蛋白质印迹聚合物选择性最优。近年来用生物亲和性好的生物分子作 为功能单体的研究受到人们的广泛重视。有壳聚糖及经化学修饰的壳聚糖制备血红蛋白、 牛血清白蛋白分子印迹聚合物；以及将环糊精分子印迹聚合物用于促进蛋白质正确折叠。总体来讲，人们一直在致力于开发一些生物亲和性好且分子结构适宜的蛋白质印 迹材料，探索简单方便的合成方法，以期获得印迹效果卓越的蛋白质分子印迹聚合物。然 而由于蛋白质是一种具有复杂空间结构和生物活性的天然生物高分子，其模板印迹难度很 大，构建对蛋白质具有分子识别特性的生物材料体系，无疑是一种挑战。主要有以下几个问 题限制了分子印迹技术在蛋白质中的运用一是蛋白质为生物大分子结构复杂且易失活， 对聚合中的单体、交联剂、引发方式以及识别体系有特殊要求；二是蛋白质为非刚性的生物 大分子，作为模板在分子印迹聚合物中很难产生确定的识别位点，需要印迹材料兼有适宜 的刚性和柔性，能与蛋白质分子柔性对接；三是庞大的蛋白质模板难以进出聚合物网络； 四是由于蛋白质分子上带有电荷或非极性基团，易发生较严重的非特异性吸附，影响选择 性识别效果；五是由于蛋白质为水溶性的，需要实现蛋白质等分子的水相中聚合及水相中 的识别，而目前大多数的分子印迹聚合物是在有机相中聚合得到的。由于上述几点，目前大 多的印迹材料和方法无法很好地实现蛋白质分子印迹。目前报道的绝大多数蛋白质分子印 迹聚合物仍然采用传统小分子印迹聚合物基质材料或类似材料，均存在一些能与蛋白质产 生较强相互作用的基团，非特异性吸附是影响其识别性能的关键共性问题。在传统的小分子印迹中，中性多糖因具较少的结合基团，印迹效果差，一般不被采 用，而在蛋白质分子印迹中，由于蛋白质大分子印迹与小分子印迹方法和机理上存在很大 差异，却因其仅与蛋白质产生较弱的氢键相互作用，具有较低的非特异性吸附成为其优点。魔芋葡甘聚糖(KonjacGlucomannan, KGM)是天南星科中魔芋(Amorphophallus Konjac)植物块茎所富含的储备性多糖，具有优良的凝胶功能和成膜特性，易修饰，在食品、 药物辅料、化妆品、化工涂料、石油等领域日益应用广泛。首先，魔芋葡甘聚糖作为一种中性 多糖，其多羟基结构可以提供大量氢键结合位点，这种弱的相互作用可最大限度避免对荷 电的蛋白质分子的非特异性吸附，而这正是壳聚糖这类带电荷多糖运用于蛋白质分子印迹 聚合物材料中存在的最大问题。同时，其链分子具有适宜的结晶区和无定形区比例，属半柔 顺性分子，可望能够对非刚性的蛋白质生物大分子柔性对接。而其他天然多糖如纤维素结 构中结晶区排列致密，琼脂糖则结构过于疏松；再者，它具有天然植物多糖的优良生物亲和 性，对蛋白质分子的活性影响较小；另外，优异的成膜性能是魔芋葡甘聚糖及其衍生物的特 性之一，已报道有多种魔芋葡甘聚糖基质膜，被广泛应用于食品保鲜、可降解塑料、高强度 可食性薄膜等领域。同时，该多糖价格相对便宜，来源丰富，提取方便，各种改性修饰方法成 熟。
技术实现思路
为了解决上述问题，尤其是减少非特异性吸附这一蛋白质分子印迹关键共性问 题，本专利技术的目的在于提供一种对模板蛋白质具有显著识别效果的分子印迹膜，还提供所 述分子印迹膜的制备方法，以及在分离检测蛋白质领域中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案本专利技术提供一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，是以4魔芋葡甘聚糖为主要基质，是按以下步骤制备得到的魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，并加入增塑剂，中和后 加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱 液充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。其中，所述交联剂包括环氧氯丙烷、戊二醛等；高分子溶液包括黄原胶、卡拉胶、海 藻酸钠、明胶、大豆分离蛋白、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇等之中 的一种或几种的混合物。所述增塑剂包括甘油、山梨醇、聚乙二醇、硬脂酸等之中的一种或几种的混合物。所述模板蛋白质分子包括各种天然活性多肽、蛋白质及其修饰物；重组活性多 肽、蛋白质及其修饰物等。所述洗脱剂包括2% 15本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，其特征在于：以魔芋葡甘聚糖为主要基质，是按以下步骤制备得到的：魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，并加入增塑剂，中和后加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱剂充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张迎庆，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]