【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的制备及使用方法。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)可引起猪流行性腹泻，表现为腹泻、呕吐和脱水等，是引起仔猪腹泻和死亡的重要病原之一，其他阶段的猪在感染后可持续带毒，给世界各地的养猪业造成了严重的经济损失。目前主要的防控措施是免疫母猪灭活疫苗和弱毒疫苗，使母猪产生母源抗体从而保护仔猪。因此，检测母猪乳汁、血液及仔猪血液中的抗pedv抗体是诊断感染或评价疫苗免疫原性的有效手段。目前pedv的血清学诊断方法主要有病毒中和试验、间接免疫荧光(ifa)、荧光微球免疫分析(fmia)和酶联免疫吸附试验(elisa)。其中elisa因具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，广泛应用于人畜疾病的检测。
2、pedv属于冠状病毒科α冠状病毒属，其中s蛋白是一种位于病毒囊膜上的ⅰ型膜糖蛋白，是pedv最大的结构蛋白，发挥着多种生物学功能。根据其结构发挥的不同功能，分为s1和s2两个结构域，其中和表位区主要为s1亚基，pedv通过s1蛋白与肠绒毛上皮细胞表面的特异性受体结合，实现病毒对宿主细胞的入侵；s1蛋白是pedv的主要抗原蛋白，能诱导机体产生特异性中和抗体，且s1蛋白有多个线性表位和b细胞表位。这些特征使s1蛋白成为pedv诊断应用中的优势蛋白。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种猪流行性腹泻病毒夹心eli
2、为达到上述技术效果，本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
3、(1)将纯化的猪流行性腹泻病毒重组s1蛋白进行包被，得到稀释后的抗原溶液，加入酶标板中包被过夜；
4、(2)加入封闭液封闭酶标板；
5、(3)在包被抗原的酶标板中分别加入待检样品、阳性对照样品和阴性对照样品，再加入酶标抗原进行共同孵育，所述酶标抗原为辣根过氧化物酶标记的猪流行性腹泻病毒s1蛋白；
6、(4)共同孵育完成后加入底物显色液，显色反应完成后终止反应并采用酶标仪测定结果。
7、作为上述技术方案的改进，步骤(3)所述共同孵育的温度为35℃～39℃，时间为30min～60min。
8、作为上述技术方案的改进，步骤(1)中抗原溶液包被酶标板的浓度为0.1μg/ml～1.0μg/ml；酶标板每孔加入抗原溶液80μl～120μl。
9、作为上述技术方案的改进，步骤(2)所述封闭酶标板的温度为35℃～39℃，时间为1h～9h。
10、作为上述技术方案的改进，步骤(3)所述待检样品为稀释后的待检血清或待检乳汁；所述待检血清的稀释度为1:(20～160)；所述待检乳汁的稀释度为1:(150～1200)。
11、作为上述技术方案的改进，步骤(3)所述酶标抗原加入前进行稀释，所述酶标抗原的稀释度为1:(5000～50000)。
12、作为上述技术方案的改进，步骤(4)所述显色反应的时间为5min～20min。
13、作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，所述阳性对照样品为抗猪流行性腹泻病毒猪血清；所述阴性对照样品为阴性无特定病原猪血清。
14、实施本专利技术实施例，具有如下有益效果：
15、本专利技术采用猪流行性腹泻病毒s1蛋白作为捕获抗原，辣根过氧化物酶标记的猪流行性腹泻病毒s1蛋白作为酶标抗原，并通过反应步骤、反应条件及试剂的协同优化，提供了猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法。
16、本专利技术建立的elisa抗体检测试剂盒的相对敏感性、相对特异性和总符合率均能达到95％以上，且试剂盒的特异性强，不与prv、csfv、ppv及prrsv阳性血清反生反应，批内和批间重复变异系数均小于8％。
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1.猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述共同孵育的温度为35℃～39℃，时间为30min～60min。
3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中抗原溶液包被酶标板的浓度为0.1μg/mL～1.0μg/mL；酶标板每孔加入抗原溶液80μL～120μL。
4.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)所述封闭酶标板的温度为35℃～39℃，时间为1h～9h。
5.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述待检样品为稀释后的待检血清或待检乳汁；所述待检血清的稀释度为1:(20～160)；所述待检乳汁的稀释度为1:(150～1200)。
6.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方
7.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)所述显色反应的时间为5min～20min。
8.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阳性对照样品为抗猪流行性腹泻病毒猪血清；所述阴性对照样品为阴性无特定病原猪血清。
...【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述共同孵育的温度为35℃～39℃，时间为30min～60min。
3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中抗原溶液包被酶标板的浓度为0.1μg/ml～1.0μg/ml；酶标板每孔加入抗原溶液80μl～120μl。
4.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)所述封闭酶标板的温度为35℃～39℃，时间为1h～9h。
5.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒夹心elisa抗体检...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊挺，陈瑞爱，庄婷婷，马光明，赵希雅，徐婷，何献铭，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，
类型：发明
国别省市：
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