【技术实现步骤摘要】
本申请属于合成生物学酵母表面展示，尤其涉及一种表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白的毕赤酵母及其制品和应用。
技术介绍
1、毕赤酵母(komagataella pastoris)是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，培养毕赤酵母菌和培养大肠杆菌一样方便。毕赤酵母表达载体的种类也很多，如ppic9k、ppiczαa或pgapzαa。
2、相关技术中，南极假丝酵母(candida antarctic)，可以产两种不同性质的脂肪酶：南极假丝酵母脂肪酶a(candida antarctic lipase a,cala)和南极假丝酵母脂肪酶b(candida antarctic lipase b,calb)。calb是应用最为广泛的一种脂肪酶，分子量小，等电点较低。calb催化活性比cala高，在酯化、水解、转酯等反应中具有很好的催化性能。但是，游离的calb存在一定的缺陷，如热稳定性差，酶的分离纯化步骤繁琐且成本很高，一般需要固定化后才能进行工业催化，酶不能重复利用，反应后的产物难以与酶分离开来，难以适应工业化条件的需求。
3、细胞表面展示技术是将酶基因与细胞壁的锚定蛋白基因融合表达，从而使表达出的酶随从锚定蛋白被展示在细胞表面上，可以使用全细胞代替酶进行催化。锚定蛋白有很多种，可以通过共价键连接到细胞壁内层的葡聚糖骨架上，分为n端展示和c端展示。如果锚定蛋白的n端结合在细胞壁上，只能在锚定蛋白的c端结合酶；如果锚定蛋白的c端结合在细胞壁上，只能在锚定蛋白的n端结合酶。为了保持酶的空间构象和活性，一般在酶与锚定蛋
4、毕赤酵母是亲水的，而酶在亲水的环境中难以发挥较好的催化能力。毕赤酵母表面单个位点展示单个蛋白时，比较浪费空间。
5、为了实现催化性能，亟需改进。
技术实现思路
1、本申请实施例提供了一种具有疏水、水解脂肪和乳化能力的毕赤酵母及其制品和应用，在此毕赤酵母的表面能够展示一种具有疏水能力、水解脂肪和乳化能力的融合蛋白，能改善对油水混合物的乳化能力和水解脂肪的能力。
2、第一方面，本申请实施例提供了一种表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白的毕赤酵母(komagataella pastoris)，所述毕赤酵母的保藏编号为gdmcc no.64138chg2-2。所述毕赤酵母的保藏日期：2023年12月11日，保藏单位：广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏地址：中国，广东，广州，广东省微生物研究所菌种保藏中心。
3、根据本申请一个方面的实施例，所述毕赤酵母表达有融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、根据本申请一个方面的实施例，编码融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.6所示。
5、根据本申请一个方面的实施例，融合蛋白包含与seq id no.1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
6、所述融合蛋白是由seq id no.2与seq id no.3所示的两蛋白通过连接肽融合而成。所述连接肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7、根据本申请一个方面的实施例，毕赤酵母包括如核苷酸序列如seq id no.5所示的三联基因的核酸。
8、根据本申请一个方面的实施例，毕赤酵母包括重组质粒，所述质粒包括如核苷酸序列如seq id no.5所示的三联基因的核酸。
9、第二方面，本申请实施例提供了一种三联基因的核酸，其核苷酸序列如seq idno.5所示。所述三联基因是由所述融合蛋白的核苷酸序列与毕赤酵母锚定蛋白的核苷酸序列再次融合而成。所述三联基因对应的氨基酸序列如seq id no.21所示。
10、第三方面，本申请实施例提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如seqid no.1所示。所述融合蛋白可与毕赤酵母锚定蛋白形成三联蛋白。
11、第四方面，本申请实施例提供了一种三联蛋白，所述三联蛋白的氨基酸序列如seqid no.21所示，所述三联蛋白为所述融合蛋白与毕赤酵母锚定蛋白再次融合而成。所述三联蛋白对应的核苷酸序列如seq id no.5。
12、第五方面，本申请实施例提供了一种重组质粒，包括如核苷酸序列如seq id no.5所示的三联基因的核酸。
13、第五方面，本申请实施例提供了一种包含毕赤酵母的制品，通过培养第一方面的毕赤酵母制得；所述制品包括毕赤酵母、发酵液、发酵液提取物、通过所述毕赤酵母制得的培养物中至少一种。
14、第六方面，本申请实施例提供了第一方面毕赤酵母(komagataella pastoris)的应用，所述应用包括在脂肪水解、酯化、转酯和乳化中的应用。
15、本申请实施例至少具有以下有益效果：
16、本专利技术在将表面展示酶的亲水毕赤酵母改造为疏水毕赤酵母时，是将疏水蛋白基因与酶基因融合表达，使其以融合蛋白的形式共同展示在毕赤酵母细胞表面的同一位点。采取的技术手段是将脂肪酶基因calb、疏水蛋白基因hfb1和锚定蛋白基因gcw6的序列融合成为一个融合基因。基因之间加入刚性连接肽papap，以维持表达出的酶的空间构象和活性。去除基因之间的信号肽序列，以免在蛋白从细胞内往细胞外分泌过程中信号肽被切除而使融合蛋白断裂，构建成为融合基因calb-papap-hfb1-papap-gcw61。将融合基因calb-papap-hfb1-papap-gcw61构建入毕赤酵母表达载体中。载体线性化后转化入毕赤酵母，使脂肪酶、疏水蛋白和锚定蛋白在毕赤酵母中融合表达，进而使得脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白被展示在毕赤酵母表面，而且把亲水毕赤酵母改造为了疏水毕赤酵母，有利于脂肪酶在疏水环境中发挥更强的催化功能。疏水蛋白与脂肪酶以融合蛋白的形式共同展示在毕赤酵母细胞表面的同一位点，使得毕赤酵母表面的空间被更有效地利用起来。毕赤酵母表面展示脂肪酶的数量更多，密度更大，催化效率更高。该毕赤酵母不但具有很好的催化水解脂肪的能力，还具有很好的乳化能力。
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1.一种表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白的毕赤酵母
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白满足下列条件中的至少一项：
3.根据权利2所述的毕赤酵母，其特征在于，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO.1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的三联基因的核酸。
5.根据权利要求1所述的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括重组质粒，所述质粒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的三联基因的核酸。
6.一种三联基因的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种三联蛋白，所述三联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述三联蛋白为所述融合蛋白与毕赤酵母锚定蛋白再次融
9.一种重组质粒，包括如核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的三联基因的核酸。
10.一种包含毕赤酵母的制品，其特征在于，通过培养权利要求1-5任意一项所述的毕赤酵母制得；所述制品包括毕赤酵母、发酵液、发酵液提取物、通过所述毕赤酵母制得的培养物中至少一种。
11.一种如权利要求1-5任意一项所述的毕赤酵母(Komagataella pastoris)的应用，所述应用包括在脂肪水解、酯化、转酯和乳化中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白的毕赤酵母
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母表面展示脂肪酶-疏水蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白满足下列条件中的至少一项：
3.根据权利2所述的毕赤酵母，其特征在于，所述融合蛋白包含与seq id no.1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括核苷酸序列如seq id no.5所示的三联基因的核酸。
5.根据权利要求1所述的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括重组质粒，所述质粒包括核苷酸序列如seq id no.5所示的三联基因的核酸。
6.一种三联基因的核酸，其核苷酸序列如seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，田勇，王小晶，田云才，戴钰，卞金玉，罗立，朱胜杰，
申请(专利权)人：上海致臻志臣科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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