【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体是一种clrb蛋白突变体及其在生产纤维素酶中的应用。
技术介绍
1、木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源之一。微生物可以降解木质纤维素转化为精细化学品及可替代能源，例如，丝状真菌作为植物生物质的有效降解者，在全球碳循环过程中发挥了重要作用，其对木质纤维素的降解主要依靠其分泌的组分多样的木质纤维素降解酶系；利用丝状真菌来源的纤维素酶和半纤维素酶将木质纤维素转化为可发酵性糖，是目前生物燃料和生物基化工产品生产技术路线中的重要途径。
2、草酸青霉被认为是木质纤维素降解酶最有效的产生菌之一，其被广泛应用于农业生物质的有效降解；但为了进一步减少木质纤维素降解过程中的用酶量以及减少纤维素乙醇生产过程的用酶成本，需要进一步提升其酶系的降解能力。草酸青霉纤维素酶基因的表达多数受到转录激活因子的调控，其中clrb是草酸青霉纤维素酶最关键的激活因子；激活因子clrb含有780个氨基酸残基，把整个clrb蛋白注释为两个保守程度不一的结构域：n端zn2cys6型dna结合结构域和真菌特有转录激活结构域，其中，由于zn2cys6型dna结合结构域主要负责与靶基因启动子结合，因此该结构域的保守性更高。
3、进一步探索草酸青霉纤维素酶合成调控的关键因子，为菌株的遗传改造提供有效的靶点，对构建高产纤维素酶菌株具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种clrb蛋白突变体及其在生产纤维素酶中的应用，通过该clrb蛋白突变体构建得到
2、本专利技术技术方案如下：
3、一种clrb蛋白突变体，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、所述clrb蛋白突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、所述clrb蛋白突变体在调控表达纤维素酶中的应用。
6、优选的，所述纤维素酶包括滤纸纤维素酶、外切纤维素酶和内切葡聚糖酶。
7、一株草酸青霉重组菌株，包含所述clrb蛋白突变体的编码基因。
8、优选的，所述草酸青霉重组菌株的出发菌株为草酸青霉114-2。
9、所述草酸青霉重组菌株的构建方法，是以酸青霉114-2作为出发菌株，将草酸青霉114-2中clrb蛋白的氨基酸序列第77位丝氨酸突变为丙氨酸；所述草酸青霉114-2中clrb蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10、优选的，所述草酸青霉重组菌株的构建方法，具体步骤为：
11、(1)制备clrb点突变表达盒：以草酸青霉114-2的基因组为模板，采用引物clrb-f1和clrbs77a-r扩增clrb点突变表达盒的上游同源臂，得片段1，采用引物clrbs77a-f和clrbhph-r扩增clrb点突变表达盒的突变后编码区，得片段2，采用引物hphclrb-f和clrb-r1扩增clrb点突变表达盒的下游同源臂，得片段3，以质粒psilent-1为模板，采用引物hph-f和hph-r扩增潮霉素抗性基因hph，得片段4；
12、将片段1～4采用融合pcr的方法进行融合，得融合片段；以融合片段为模板，采用引物clrb-f2和clrb-r2扩增，得clrb点突变表达盒；
13、(2)制备草酸青霉原生质体；
14、(3)在步骤(2)制备得到的草酸青霉原生质体中加入步骤(1)的clrb点突变表达盒进行原生质体的转化，得转化子；
15、(4)对步骤(3)的转化子进行纯化和pcr验证，得到clrb突变纯合子菌株，即草酸青霉重组菌株。
16、其中，步骤(1)中所述clrb-f1、clrbs77a-r、clrbs77a-f、clrbhph-r、hphclrb-f、hph-f、hph-r、clrb-f2、clrb-r2、clrb-r1的核苷酸序列分别如seq id nos.4～13所示。
17、其中，步骤(4)中所述pcr验证所用引物分别为clrb-f0和hphyz-r、hphyz-f和clrb-r0，其核苷酸序列分别如seq id nos.14～17所示。
18、所述草酸青霉重组菌株在生产纤维素酶中的应用。
19、优选的，所述纤维素酶包括滤纸纤维素酶、外切纤维素酶和内切葡聚糖酶。
20、一种clrb点突变表达盒，包含所述clrb蛋白突变体的编码基因。
21、一种生产纤维素酶的试剂盒，包括所述clrb点突变表达盒。
22、优选的，所述试剂盒还包括原生质体转化试剂、染色体抽提试剂、pcr扩增试剂和电泳试剂。
23、一种生产纤维素酶的方法，是将所述clrb点突变表达盒转化到草酸青霉中构建重组菌株，利用所述重组菌株生产纤维素酶。
24、有益效果：
25、(1)本专利技术提供了一种clrb蛋白突变体，包含该clrb蛋白突变体的草酸青霉重组菌株不仅能够在不同碳源的培养基中良好的生长，而且该重组菌株所产生的滤纸纤维素酶、内切葡聚糖酶以及外切纤维素酶的酶活性分别是出发菌株草酸青霉114-2的2.5倍、1.2倍和1.4倍，降低培养成本的同时还提高了酶的活性；
26、(2)本专利技术所提供的氨基酸突变位点可以为更多丝状真菌如草酸青霉的遗传改造提供靶点启示，具有良好的应用前景。
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1.一种ClrB蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述ClrB蛋白突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
3.权利要求1所述ClrB蛋白突变体在调控表达纤维素酶中的应用。
4.一株草酸青霉重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述ClrB蛋白突变体的编码基因。
5.如权利要求4所述的草酸青霉重组菌株，其特征在于，所述草酸青霉重组菌株的出发菌株为草酸青霉114-2。
6.权利要求4所述草酸青霉重组菌株在生产纤维素酶中的应用。
7.一种ClrB点突变表达盒，其特征在于，包含权利要求2所述ClrB蛋白突变体的编码基因。
8.一种生产纤维素酶的试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的ClrB点突变表达盒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括原生质体转化试剂、染色体抽提试剂、PCR扩增试剂和电泳试剂。
10.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述的ClrB点突变表达盒转化到草酸青
...【技术特征摘要】
1.一种clrb蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.权利要求1所述clrb蛋白突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.3所示。
3.权利要求1所述clrb蛋白突变体在调控表达纤维素酶中的应用。
4.一株草酸青霉重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述clrb蛋白突变体的编码基因。
5.如权利要求4所述的草酸青霉重组菌株，其特征在于，所述草酸青霉重组菌株的出发菌株为草酸青霉114-2。
6.权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李忠海，孙秋燕，陈梅，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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