【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的，涉及一种肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母系统及其构建方法与应用。
技术介绍
1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)是一种无囊膜的单股环状dna病毒，是最小的dna病毒之一，目前已发现pcv1、pcv2、pcv3以及pcv4。其中pcv2为致病性病毒，与断奶仔猪多系统衰竭综合症(pmws)、猪皮炎与肾病综合症(pdns)、仔猪先天性震颤、呼吸疾病和猪腹泻综合症(pds)等猪的多种疾病有关，是最具威胁的毒株，且pcv2d目前己是主要流行亚型。众多研究表明，单独感染pcv不会导致明显的临床症状，只产生轻微的临床症状和组织损伤。但猪圆环病毒能够通过损伤猪的免疫系统，使其免疫力降低，从而使其易感或并其他疾病如:猪链球菌病、猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪繁殖与呼吸障碍综合征等疾病，从而这些病毒与pcv联合感染也能增pmws的临床症状，对全球的养猪业造成了重大危害。
2、迄今为止，国内上市的猪圆环疫苗主要为pcv2全病毒灭活疫苗和杆状病毒表达的亚单位。因此如何通过一定的表达途径高效表达pcv2主要免疫原性蛋白并研制疫苗，为临床防控猪圆环病毒病提供安全、高效和价廉的pcv2疫苗，具有重要的应用价值。
3、酵母表达系统作为一个高效的蛋白表达系统，具有成本低、蛋白可溶性表达等优点。且布拉迪酵母作为酿酒酵母的一个亚种，与其他益生细菌相比，具有天然抵御所有抗生素的优势，与其他酿酒酵母比较，布拉迪酵母具有耐高温和耐酸性能的优点，在肠道中体现出更快的生长速率。199
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统。
2、本专利技术的第二个目的是提供一种肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统。
3、本专利技术的第三个目的是提供一种肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统的应用。
4、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
5、一种cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统，该表达系统的制备方法如下：
6、s1、分别构建hyhmx6抗性、kanr抗性的同源臂，逐一插入替换掉布拉迪酵母染色体上cup1的等位基因，再引入cre-loxp重组酶系统对hyhmx6/kanr抗性进行消除，即得s.bδcup1；
7、s2、分别构建hyhmx6抗性、kanr抗性的同源臂，逐一插入替换掉s.bδcup1染色体上ura3的等位基因，再引入cre-loxp重组酶系统对hyhmx6/kanr抗性进行消除，即得s.bδcup1δura3。
8、首先为了提高s.b对cu2+的响应性，将s.b中编码金属硫蛋白的cup1基因及其启动子通过loxp/cre重组酶系统进行敲除，构建了cu2+高敏感性s.b菌株(s.bδcup1)，并将携带egfp基因质粒pcevhyg-αf-egfp的tef启动子改造为cup1启动子，以保证可通过cu2+进行诱导表达，同时，构建胞内表达载体实现外源蛋白的胞内表达。其次为了稳定表达外源蛋白，进一步提高外源蛋白表达水平，在此基础上通过loxp/cre重组酶系统构建了尿嘧啶(uracil)营养缺陷型s.b菌株(s.bδcup1δura3)，然后将携带hyg筛选标记(hyhmx6)的质粒pcup1hyg-αf-egfp改造成uracil筛选标记(ura3)，以保证重组质粒在s.bδcup1δura3中不会丢失，同时，构建胞内表达载体实现外源蛋白的胞内表达。
9、本专利技术首次通过同时敲除s.b的cup1和ura3基因，构建了cup1/ura3双基因缺失株，命名为s.bδcup1δura3，该工程菌同时具有cu2+高敏感性和uracil营养缺陷表型。以egfp为指示蛋白进行表达可见，该表达系统可利用廉价cu2+作为诱导剂，实现在较低cu2+浓度诱导下的外源蛋白分泌及胞内可控表达，并且具有的好的菌株稳定性。该表达系统利用廉价cu2+作为诱导剂，实现益生菌s.b可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。
10、本专利技术还提供所述cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统的应用。
11、本专利技术还提供一种肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，是将融合了α因子信号肽的pcv2 cap基因序列转入所述的s.bδcup1δura3中得到。
12、优选地，所述的肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，其构建方法包括以下步骤：
13、(1)构建pcup1ura3-αf-pcv2 cap质粒：扩增pcv2 cap序列，另以pcup1ura3-αf-egfp质粒为模板，扩增除egfp以外的载体骨架部分；将pcv2 cap回收片段和载体骨架片段采用同源重组得到pcup1ura3-αf-pcv2 cap质粒；
14、(2)转化：将pcup1ura3-αf-pcv2 cap质粒转入s.bδcup1δura3中，即得肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统。
15、本专利技术首次通过将融合了α因子信号肽的pcv2 cap基因序列转入益生菌s.bδcup1δura3中，构建得到工程s.bδcup1δura3/pcup1-αf-pcv2 cap，该工程酵母可分泌表达pcv2 cap蛋白。通过小鼠灌胃试验可见，该工程酵母能在小鼠肠道原位环境中通过cu2+诱导表达pcv2 cap蛋白，且具有一定的免疫原性，能分别诱导产生th1型和th2型免疫应答。
16、因此，本专利技术还提供所述肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在分泌表达pcv2 cap蛋白中的应用。
17、本专利技术还提供所述肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在制备pcv2疫苗中的应用。优选地，所述疫苗为口服疫苗。
18、本专利技术还提供所述肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在制备提升免疫应答的药物中的应用。优选地，所述免疫应答为th1型和th2型。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
20、本专利技术首先提供能够表达猪圆环病毒2d亚型cap蛋白(以下简称pcv2 cap)的益生菌s.bδcup1δura3，该菌株能在肠道利用廉价的cu2+作为诱导剂，实现益生菌s.b可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。本专利技术首次通过将融合了α因子信号肽的pcv2 cap基因序列转入益生菌s.bδcup1δura3中，构建得到工程s.bδcup1δura3/pcup1-αf-pcv2cap，该工程酵母可分泌表达pcv2 cap蛋白。通过小鼠灌胃试验可见本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统，其特征在于，该表达系统的制备方法如下：
2.权利要求1所述Cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统的应用。
3.一种肠道原位诱导表达PCV2 Cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，其特征在于，是将融合了α因子信号肽的PCV2 Cap基因序列转入权利要求1所述的S.bΔCUP1ΔURA3中得到。
4.根据权利要求3所述的肠道原位诱导表达PCV2 Cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，其特征在于，表达系统的构建方法包括以下步骤：
5.权利要求3所述肠道原位诱导表达PCV2 Cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在分泌表达PCV2 Cap蛋白中的应用。
6.权利要求3所述肠道原位诱导表达PCV2 Cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在制备PCV2疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗为口服疫苗。
8.权利要求3所述肠道原位诱导表达PCV2 Cap蛋白的布拉迪酵母表达系统在制备提升免疫应答的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫应
...【技术特征摘要】
1.一种cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统，其特征在于，该表达系统的制备方法如下：
2.权利要求1所述cu2+诱导型布拉迪酵母表达系统的应用。
3.一种肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，其特征在于，是将融合了α因子信号肽的pcv2 cap基因序列转入权利要求1所述的s.bδcup1δura3中得到。
4.根据权利要求3所述的肠道原位诱导表达pcv2 cap蛋白的布拉迪酵母表达系统，其特征在于，表达系统的构建方法包括以下步骤：
5.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙坚，陆菊，黄毓茂，贺骞，任昊，廖晓萍，刘雅红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。