【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检测，具体涉及免提取、免扩增、高灵敏度的活菌定量检测方法及其应用。
技术介绍
1、据世界卫生组织(who)报道，不安全食品每年造成6亿例食源性疾病以及导致42万人死亡，食源性疾病发病率居各类疾病总发病率首位，而食源性病原菌是造成食源性疾病的主要原因。因此，准确检测食源性病原菌是保障食品安全的重要手段。
2、传统的病原菌培养检测方法非常耗时，通常需要2-5天，并且无法检测不可培养状态的菌株。近年来，一些基因水平的检测方法，如pcr、rt-pcr、免疫富集pcr、免疫磁性分离pcr等的实时荧光扩增技术和其他等温核酸扩增技术在病原菌检测中显示出快速、高灵敏度的优异性能。这些核酸扩增方法虽然可以在短时间内实现核酸指数扩增，但是仍然面临引物设计复杂、易发生非特异性扩增等问题。crispr效应蛋白由于能够精准识别核酸序列并具有侧切活性，成为了检测食源性病原菌的新工具，并被广泛应用于基于核酸的检测。但是crispr/cas需要依赖pam识别位点，而pam在很多生物基序中都不存在。另外crispr/cas酶需要在crrna引导下进行切割，而rna极容易被降解，因此，crispr的应用一直受到很大限制。argonaute(ago)蛋白是广泛应用于检测的核酸引导酶，可以通过碱基互补配对精准识别靶核酸序列。其中从古激烈火球菌( pyrococcus furiosus)中分离出来的ago蛋白，在高温条件下，可以通过5’端磷酸化的单链dna(gdna)引导，切割互补目标链的第10位和第11位碱基
3、目前对于活/死菌的检测，一般是利用叠氮溴化丙锭染料或者钙黄绿素-eth3染料结合实时荧光定量pcr进行活菌定量检测，相比传统染料法具有灵敏度高、操作简便和结果容易分辨等特点，但是仍需借助扩增步骤提高检测灵敏度，因此无法避免交叉污染风险。目前也有一些研究将rna作为活菌指示物，通过检测rna实现活菌定量检测，但是rna容易受多种环境因素影响降解而造成假阳性，影响检测结果稳定性和准确性。另一方面，部分学者认为这里的rna指mrna，而mrna是蛋白质表达的载体，能检测到mrna只能证明靶标菌株正在进行复制表达，并不能分辨靶标菌株的死活，并且mrna的表达量较低，不易被检测到。鉴于以上活菌检测技术存在的缺陷，有必要开发一种准确、高灵敏的活菌定量检测方法。
4、细胞内源性三磷酸腺苷（atp）的含量可以反应活细胞数量，且二者之间具有良好的线性关系，可以为准确的活菌定量检测方法提供新的思路。基于此，目前利用atp生物发光测定活细胞数量的检测技术已经广泛应用于食品工业，例如测定肉类食品中细菌污染情况，乳制品中乳酸菌的含量以及脱水蔬菜的细菌学测定等。然而，atp存在于多种细胞中，该类检测技术缺乏识别细菌种类的能力，样品基质中的非靶标菌株则会影响检测结果准确性。因此，为实现准确的活菌定量还需要提高对靶标菌株的特异性识别能力。
5、噬菌体是侵染细菌的病毒，是地球上最古老、最丰富的生物实体。噬菌体只会攻击特定的宿主，不会破坏正常菌群。因此，噬菌体具有特异性高、安全和研发成本低的特点。噬菌体可以特异性地识别并裂解活的宿主细菌，并释放细胞裂解产物，如dna和atp等。因此利用噬菌体特异性识别并裂解病原菌活菌可以检测病原菌活菌中的dna和atp，从而解决现有atp生物发光检测技术中存在的无法识别细菌种类而造成的假阳性问题。通过结合现有的检测工具可以进一步实现准确、高灵敏的食源性病原菌活菌定量检测。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种免提取、免扩增、高灵敏度的活菌定量检测方法及其应用，使检测过程操作简单，结果判读准确，提高检测灵敏度，为食源性病原菌活菌检测提供快速、准确、高灵敏、特异性强的技术手段。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术利用噬菌体进行核酸免提取，利用 pfago酶作为核酸引导酶，精准识别靶标菌株核酸序列，利用二价适配体捕获atp分子，构建了一种基于dna和atp协同触发的 pfago介导的生物传感系统和增强系统，用于无需核酸提取和扩增即可高灵敏定量检测食源性病原菌活菌。
3、本专利技术技术方案如下：
4、一种活菌检测试剂盒，包括：
5、引导 pfago酶靶向细菌的gdna，具体为如序列seq id no.1所示的gdna-1、如序列seq id no.2所示的gdna-2以及如序列seq id no.3所示的gdna-3；
6、引导 pfago酶切割荧光探针1的gdna，所述gdna为gdna-1、gdna-2和gdna-3引导 pfago酶靶向细菌切割下来的部分dna片段，具体为如序列seq id no.4所示的gdna-4；
7、引导 pfago酶切割荧光探针2的gdna，所述gdna为与atp适配体杂交构成二价适配体的寡核苷酸序列，具体为如序列seq id no.5所示的gdna-5；
8、用于构建针对atp的二价适配体，所述二价适配体由两条atp适配体序列和一条寡核苷酸序列杂交所得，具体为如序列seq id no.6所示的atp适配体以及具体为如序列seqid no.5所示的寡核苷酸序列；
9、带有荧光基团和猝灭基团的荧光探针，具体为如seq id no.7所示的荧光探针1以及如序列seq id no.8所示的荧光探针2；
10、所述检测试剂盒用于细菌的定量检测或辅助定量检测，且所述定量检测或辅助定量检测以食源性病原菌活菌定量检测或辅助定量检测为目的。
11、优选地，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028。
12、一种活菌定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
13、s1：设计gdna：
14、s2：制备磁性纳米颗粒-噬菌体复合物(mnp-phage)：用mest缓冲液洗涤1000nm大本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种活菌检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的活菌检测试剂盒，其特征在于，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028。
3.一种活菌定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，根据需要检测的细菌核酸序列分别设计三条与之互补的15-22 nt gDNA，分别命名为gDNA-1，gDNA-2和gDNA-3；在gDNA-1，gDNA-2和gDNA-3引导下，激活PfAgo酶切割后，释放的一条15-22 nt新DNA片段作为次级gDNA，命名为gDNA-4；一条15-22 nt可以与ATP适配体杂交形成二价适配体的寡核苷酸序列，命名为gDNA-5；其中，所述的gDNA 5’端的碱基被磷酸基团修饰；所述gDNA-4与16-25 nt荧光探针1序列互补；所述gDNA-5与16-25 nt荧光探针2序列互补。
5.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，用MEST缓冲液洗涤羧基修饰的1000nm大小磁性纳米颗粒；磁分离后，用
6.根据权利要求3或5所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，加入5mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐10-30 uL和5 mg/mL N -羟基琥珀酰亚胺10-30 uL；
7.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
8.根据权利要求3或7所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S3.1中，加入5mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐10-30 uL和5 mg/mL N -羟基琥珀酰亚胺10-30 uL；
9.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，将MNP-Phage溶液与菌液以体积比为1:1混匀进行孵育；
10.权利要求1-2任意一项所述活菌检测试剂盒或权利要求3-9任意一项所述活菌定量检测方法用于食源性病原菌定量检测。
...【技术特征摘要】
1.一种活菌检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的活菌检测试剂盒，其特征在于，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028。
3.一种活菌定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤s1中，根据需要检测的细菌核酸序列分别设计三条与之互补的15-22 nt gdna，分别命名为gdna-1，gdna-2和gdna-3；在gdna-1，gdna-2和gdna-3引导下，激活pfago酶切割后，释放的一条15-22 nt新dna片段作为次级gdna，命名为gdna-4；一条15-22 nt可以与atp适配体杂交形成二价适配体的寡核苷酸序列，命名为gdna-5；其中，所述的gdna 5’端的碱基被磷酸基团修饰；所述gdna-4与16-25 nt荧光探针1序列互补；所述gdna-5与16-25 nt荧光探针2序列互补。
5.根据权利要求3所述的活菌定量检测方法，其特征在于，所述步骤s2中，用mest缓冲液洗涤羧基修饰的1000nm大小磁性纳米颗粒；磁分离后，用500-1000 ul mes缓冲液重悬，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n -羟基琥珀酰亚胺，置于旋转混合仪上以300-500 rpm/min旋转混匀，25-37℃活化15-30...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。