【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器及其用途。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor-tcell,car-t)是将单链可变结构域片段(single-chain fragment variable，scfv)与t细胞表面受体嵌合于t细胞上，从而使得t细胞不依赖主要组织相容性复合体i(major histocompatibility complexi，mhci)而识别肿瘤细胞，再经纯化、体外扩增及活化，将car-t细胞回输至患者体内，使其特异性行使杀灭肿瘤细胞的功能。car载体主要由3部分构成：抗原结合域、跨膜区及胞内信号转导区。
2、在car-t分子中，细胞内信号转导结构域发挥重要作用。在car工程中car的共刺激的效果备受关注，目标是生成具有最佳胞内结构域的car构建体。两个最常见的获得fda批准的共刺激结构域cd28和4-1bb(cd137)都与较高的患者反应率相关。cd28和4-1bb功能上存在差异。cd28主要促进car-t增殖，增强效应功能，尤其是细胞因子的产生。4-1bb则促进car-t体内的存活和延长留存时间。临床结果表明car-t细胞在治疗血液系统恶性肿瘤具有极大的优势。
3、肿瘤靶点的选择是决定car-t治疗成败的关键因素，所选择的肿瘤特异性抗原需在肿瘤组织高表达而在重要组织不表达或表达水平极低。
4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，gpc3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan
5、双特异性t细胞衔接器(bispecific t-cell engager，bite)代表一类具有显著抗肿瘤效应的双特异性抗体，能够靶向性激活自身t细胞杀伤肿瘤细胞。bite由两个单链可变片段(single-chain fragment variable，scfv)组成，通过柔性接头串联连接。一个scfv识别t细胞表面蛋白cd3ε，而另一个scfv识别特异性肿瘤细胞表面抗原。bite的这种结构和特异性结合蛋白的能力允许它将t细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成t细胞-bite-肿瘤细胞复合物，诱导免疫突触形成，刺激t细胞活化，产生杀伤肿瘤的细胞因子。近年来，bite在抗肿瘤研究中取得了显著进展，在临床上取得了理想的治疗效果。
6、传统的scfv通常按照以下原则来设计：
7、1、根据igg抗体的序列提取出其可变区片段fv，包含两个肽链，重链可变区vh和轻链可变区vl；
8、2、将vh和vl通过连接子链接在一起成为单一肽链(vh-vl或者vl-vh)；
9、3、(gly4ser)3是目前最常用的连接肽之一，该连接肽柔软。但是现有技术存在以下缺陷：1)(g4s)3连接肽太短，使连接的scfv空间构象与天然的抗体结构相去甚远；2)现有靶向gpc3的scfv对肿瘤细胞的杀伤效果有限。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器及其用途。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器，包括通过连接肽linker依次连接的αgpc3轻链可变区vl、αgpc3的重链可变区vh，αcd3重链可变区vh、αcd3的轻链可变区vl，所述vlαgpc3的氮端与vhαgpc3的氮端连接，vhαgpc3的碳端与vhαcd3的碳端连接，vhαcd3的氮端与vlαcd3的氮端连接。
3、进一步地，所述连接肽linker的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述αgpc3轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no.2所示，αgpc3的轻链可变区vh的核苷酸序列如seq idno.3所示，αcd3重链可变区vh的核苷酸序列如seq id no.4所示、αcd3的轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no.5所示。
4、一种核酸分子，包含上述的cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器。
5、一种表达载体，包含上述的核酸分子。
6、进一步地，所述表达载体为分泌性表达载体，表达质粒为增强型肌肉特异性表达质粒pems，pems的启动子为ems，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
7、进一步地，它还包括小鼠igκ信号肽，所述小鼠igκ信号肽的核苷酸序列如seq idno.7所示。
8、一种细胞株，包含上述的表达载体。
9、一种细胞株的构建方法，它包括以下步骤：
10、s1.合成cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器的目的基因片段；
11、s2.将步骤s1构建的目的基因片段克隆连接至plvx-puro载体上形成转染质粒；
12、s3.将pspax2质粒、pmd2.g和转染质粒共转到hek293t细胞，获得病毒液；
13、s4.病毒液感染cho-k1细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株，获得稳定表达转染质粒的cho-k1细胞株。
14、上述的cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器、核酸分子、表达载体、细胞株在制备抗肿瘤药物中的用途。
15、进一步地，所述肿瘤为肝癌。
16、本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器改变了传统bite的连接方式，通过基因工程技术重排蛋白编码基因的密码子序列，使scfv的轻/重链氨基酸序列跟原序列完全相同但翻译方向相反，这样形成的bite结构更接近天然抗体分子的构象，在骨骼肌进行质粒注射后，7-14天即能检测到治疗性蛋白的表达，该表达蛋白能够激活并维持t细胞活性、促进其增殖，并且cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器能同时识别并衔接肿瘤细胞和t细胞，引导t细胞杀死肝癌细胞，对肿瘤的杀伤效果好；本专利技术利用骨骼肌分泌治疗性蛋白，在体内对患者t细胞进行修饰，避免了异体car-t疗法导致的移植物抗宿主反应(graft versus host reaction，gvhr)以及宿主抗移植物反应(host versus graftreaction，hvgr)，降低了抗肿瘤的治疗成本。
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1.一种CD3ε和GPC3双特异性T细胞衔接器，其特征在于，包括通过连接肽Linker依次连接的αGPC3轻链可变区VL、αGPC3的重链可变区VH，αCD3重链可变区VH、αCD3的轻链可变区VL，所述VLαGPC3的氮端与VHαGPC3的氮端连接，VHαGPC3的碳端与VHαCD3的碳端连接，VHαCD3的氮端与VLαCD3的氮端连接；
2.根据权利要求1所述的一种CD3ε和GPC3双特异性T细胞衔接器，其特征在于，所述连接肽Linker的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示，所述αGPC3轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID No .2所示，αGPC3的轻链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示，αCD3重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID No .4所示、αCD3的轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ IDNo .5所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，包含权利要求1或2所述的CD3ε和GPC3双特异性T细胞衔接器。
4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述
6.根据权利要求5所述的一种表达载体，其特征在于，它还包括小鼠Igκ信号肽，所述小鼠Igκ信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No .7所示。
7.一种细胞株，其特征在于，包含权利要求4所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的一种细胞株的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：
9.权利要求1或2所述的CD3ε和GPC3双特异性T细胞衔接器、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5或6所述的表达载体、权利要求7所述的细胞株在制备抗肿瘤药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
...【技术特征摘要】
1.一种cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器，其特征在于，包括通过连接肽linker依次连接的αgpc3轻链可变区vl、αgpc3的重链可变区vh，αcd3重链可变区vh、αcd3的轻链可变区vl，所述vlαgpc3的氮端与vhαgpc3的氮端连接，vhαgpc3的碳端与vhαcd3的碳端连接，vhαcd3的氮端与vlαcd3的氮端连接；
2.根据权利要求1所述的一种cd3ε和gpc3双特异性t细胞衔接器，其特征在于，所述连接肽linker的核苷酸序列如seq id no .1所示，所述αgpc3轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no .2所示，αgpc3的轻链可变区vh的核苷酸序列如seq id no .3所示，αcd3重链可变区vh的核苷酸序列如seq id no .4所示、αcd3的轻链可变区vl的核苷酸序列如seq idno .5所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，包含权利要求1或2所述的cd3ε和gpc3双特异性...
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