【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种bite及其在抗肿瘤药物中的用途。
技术介绍
1、磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican 3，gpc3)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。gpc3基因编码产生70kda左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40kda左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(n末端)肽和30kda左右含有2个硫酸乙酰肝素(hs)糖链的膜结合的竣基端(c末端)肽。gpc3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。
2、基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase，mmp)家族可能是通过降解细胞外基质，破坏细胞粘附分子的正常组织结构，联合其它相关的酶降解血管周围的基质，从而有利于肝癌细胞的浸润、转移。mmp-9是基质金属蛋白酶家族中质量较大的一类酶。有学者通过免疫组化和蛋白印迹实验检测发现肝癌组织中mmp-9的表达情况，结果发现肝癌的中mmp-9表达过高。
3、双特异性抗体(bispecific antibody，biab)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够特异性识别和结合两个不同的抗原或抗原表位，其可以在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，将特定的免疫细胞重新定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，或者同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能。用于
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种靶向性强且空间构象更接近天然抗体的双特异性抗体及其在抗肿瘤药物中的用途。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
3、本专利技术第一方面提供一种bite，所述bite包括αgpc3轻链可变区vl、αgpc3的重链可变区vh，αcd3重链可变区vh、αcd3的轻链可变区vl、mmp-9可降解的多肽底物、igg抗体铰链区和形成二硫键的多肽pps-s，按以下顺序连接：
4、vlαgpc3-多肽pps-s-底物-igg抗体铰链区-多肽pps-s-vhαgpc3-底物-vhαcd3-多肽pps-s-igg抗体铰链区-底物-多肽pps-s-vlαcd3；
5、所述vlαgpc3的c端与vhαgpc3的c端之间、vhαcd3的c端与vlαcd3的c端之间通过多肽pps-s形成二硫键，vhαgpc3 c端的igg抗体铰链区与vhαcd3 c端的igg抗体铰链区形成二硫键连接；
6、所述mmp-9可降解的多肽底物的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、进一步地，所述αgpc3轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no.2所示，αgpc3的重链可变区vh的核苷酸序列如seq id no.3所示，αcd3重链可变区vh的核苷酸序列如seq idno.4所示、αcd3的轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述igg抗体的铰链区的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述形成二硫键的基因序列如seq id no.7所示。
8、本专利技术第二方面提供一种核酸分子，包含上述的bite。
9、进一步地，具有seq id no.8所示的核苷酸序列。
10、本专利技术第三方面提供一种分泌型表达载体，包含上述的核酸分子。
11、进一步地，所述表达载体为增强型肌肉特异性表达质粒pems，pems的启动子为ems，其核苷酸序列如seq id no.9所示，且在启动子ems后多克隆位点区添加小鼠igκ信号肽，所述小鼠igκ信号肽的核苷酸序列如seq id no.10所示。
12、本专利技术第四方面提供一种细胞株，包含上述的核酸分子或上述的分泌型表达载体。
13、本专利技术还提供了一种细胞株的构建方法，所述构建方法为：
14、s1.合成权利要求1所述的目的基因片段；
15、s2.将步骤s1构建的目的基因片段克隆连接至plvx-puro载体上形成转染质粒；
16、s3.将pspax2质粒、pmd2.g和转染质粒共转到hek293t细胞，获得病毒液；
17、s4.病毒液感染cho-k1细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株，获得稳定表达转染质粒的cho-k1细胞株。
18、本专利技术第五方面提供一种药物组合物，包含上述的bite、上述的核酸分子、上述的分泌型表达载体、上述的宿主细胞或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19、“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本专利技术所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
20、本专利技术第六方面提供上述的bite、上述的核酸分子、上述的分泌型表达载体、上述的宿主细胞、上述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为肝癌。
21、本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的靶向肝癌细胞高表达的gpc3和t细胞上的cd3蛋白的α-gpc3×α-cd3双特异性抗体，将传统的连接肽(gly4ser)3替换为可被mmp-9降解的多肽底物进行连接，在骨骼肌进行质粒注射后，7-14天即能检测到治疗性蛋白的表达，当骨骼肌表达产生的双特异性抗体通过血液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种BiTE，其特征在于，所述BiTE包括αGPC3轻链可变区VL、αGPC3的重链可变区VH，αCD3重链可变区VH、αCD3的轻链可变区VL、MMP-9可降解的多肽底物、IgG抗体铰链区和形成二硫键的多肽PPS-S，按以下顺序连接：
2.根据权利要求1所述的一种BiTE，其特征在于，所述αGPC3轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID No .2所示，αGPC3的重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示，αCD3重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID No .4所示、αCD3的轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQID No .5所示，所述IgG抗体的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No .6所示，所述形成二硫键的基因序列如SEQ ID No .7所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，包含权利要求1或2所述的BiTE。
4.根据权利要求3所述的一种核酸分子，其特征在于，具有SEQ ID No .8所示的核苷酸序列。
5.一种分泌型表达载体，其特征在于，包含权利要求3或4所述的核酸分子。
6.根据
7.一种细胞株，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的分泌型表达载体。
8.根据权利要求7所述的一种细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2中所述的BiTE、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5或6所述的分泌型表达载体、权利要求7或8所述的宿主细胞或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求1或2中所述的BiTE、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5或6所述的分泌型表达载体、权利要求7或8所述的宿主细胞、权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为肝癌。
...【技术特征摘要】
1.一种bite，其特征在于，所述bite包括αgpc3轻链可变区vl、αgpc3的重链可变区vh，αcd3重链可变区vh、αcd3的轻链可变区vl、mmp-9可降解的多肽底物、igg抗体铰链区和形成二硫键的多肽pps-s，按以下顺序连接：
2.根据权利要求1所述的一种bite，其特征在于，所述αgpc3轻链可变区vl的核苷酸序列如seq id no .2所示，αgpc3的重链可变区vh的核苷酸序列如seq id no .3所示，αcd3重链可变区vh的核苷酸序列如seq id no .4所示、αcd3的轻链可变区vl的核苷酸序列如seqid no .5所示，所述igg抗体的铰链区的核苷酸序列如seq id no .6所示，所述形成二硫键的基因序列如seq id no .7所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，包含权利要求1或2所述的bite。
4.根据权利要求3所述的一种核酸分子，其特征在于，具有seq id no .8所示的核苷酸序列。
5.一种分泌型表达载体，其特征在于，包含权利要求3...
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