【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体是一种牡蛎成分的实时荧光pcr检测方法。
技术介绍
1、牡蛎（学名：ostreidae）是珍珠贝目、牡蛎科软体动物的统称，俗称海蛎子、蚝等。牡蛎是世界性广布类群，除两极外，从赤道到亚寒带海域到处都有分布，主要分布在温带及亚热带地区。牡蛎是世界第一大养殖贝类，是人类可利用的重要海洋生物资源之一。全世界约有牡蛎100余种，其中具有商业价值的的牡蛎大约有20种。
2、牡蛎自古便是珍馐佳肴，以味道鲜美而闻名，牡蛎肉富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等多种营养成分。除食用价值外，牡蛎肉和壳还可入药，具有独特的保健功能和药用价值。但同时牡蛎也可引发部分人群发生各类过敏反应症状，属于被欧盟要求强制标识的14类食品过敏原中的软体动物。
3、随着牡蛎进出口贸易的不断增加和相关产品的不断开发，牡蛎源性成分的检测需求也在提高。实时荧光pcr技术简便、快速、特异性强，灵敏度高，目前已成功用于食品和饲料中牛、羊、猪、鸡、鱼等动物源性成分的鉴定，鉴于此，本研究拟建立牡蛎源性成分的实时荧光pcr检测方法。该方法一方面可用于进出口牡蛎的种属鉴别，满足进出口贸易中海关查验的需要。另一方面也可用于牡蛎类精深加工产品的掺杂掺假和食品过敏原检测，从而保护消费者的经济利益，保障贸易公平和食品安全。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种牡蛎成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，克服基于蛋白的检测方法在某些食品
2、本专利技术的主要原理为：针对保守序列设计一组特异性引物和一条特异性taqman探针，经优化反应体系和反应程序，最终建立待测样品的实时荧光pcr检测方法。进行核酸检测时，模板dna经加热至94-95℃一定时间后，dna双链解离，引物及taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3'→5'外切核酸酶活性就会将探针切断,报告集团远离淬灭集团,其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着pcr循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
3、本专利技术涉及的牡蛎成分快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
4、（1）2×pcr master mix
5、包括0.05 u/µl taq dna聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/l氯化镁，0.4 mmol/l dntp(四种脱氧核糖核酸的混合物)；
6、其中反应缓冲液含有20 mmol /l ph8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100mmol/l氯化钾和2％曲拉通x－100；
7、（2）上游引物：10µmol/l，序列为：5'- tgttacgcttcacgacactt -3'；
8、（3）下游引物：10µmol/l，序列为：5'- tgccgatgcattataaccttagc -3'；
9、（4）taqman探针：10µmol/l，序列为：5'- acaccgcacccattgataagacgtagt -3'，其5'端标记fam报告荧光集团，3'端标记bhq1淬灭荧光集团。
10、本专利技术还提供上述试剂盒检测食品和饲料中牡蛎成分的方法，依次包括下列步骤（1）-（3）：
11、（1）待检样品dna的提取
12、dna 提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用dna 提取试剂盒。
13、（2）牡蛎成分的实时荧光pcr扩增
14、a. 在反应管中加入2×pcr master mix 12.5 µl，上游引物和下游引物各0.5-1µl，taqman探针0.5-1µl，100ng/µl待测样品的dna 1-2 µl，补充双蒸水至25 µl，混匀；
15、b. 将pcr反应管放入荧光定量pcr仪，按下述反应条件完成pcr扩增：
16、94－95℃ 5min，１个循环，预变性；
17、94－95℃ 10－20sec；60℃ 20－40sec，45个循环，pcr扩增。
18、扩增时，应设立三个对照：阳性对照（取牡蛎肉提取的基因组dna）、阴性对照（非牡蛎基因组dna）、空白对照（不含dna模板，可以水代替）。
19、（3）应用荧光定量pcr仪随机软件，分析扩增结果。
20、如待测样品出现扩增曲线，且ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立（即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增），则可判定该样品检出牡蛎成分。
21、如待测样品未出现扩增曲线，无ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出牡蛎成分。
22、如待测样品ct值在41-45之间，应重作实时荧光pcr扩增。再次扩增后的结果ct值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出牡蛎成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出牡蛎成分。
23、线粒体dna是动物体内唯一存在核外遗传信息载体，为共价闭合的双链环状分子，具有母系遗传、进化速度快、种属特异性等特点。对同一个体的肾脏、心脏、肝脏、皮肤等不同组织的研究、比较表明，线粒体dna的结构没有组织特异性。而且线粒体dna拷贝数多，可达数千到上万个，远高于核dna，即使样品经过深度加工，核dna降解严重或dna含量极少时，仍可通过pcr扩增检出线粒体dna，因此线粒体 dna基因序列被广泛用于物种鉴定。细胞色素c氧化酶是由多个亚基组成的、在生物体代谢过程中起重要作用的复杂酶分子，其诸多亚基中最大最保守的亚基为细胞色素c氧化酶ｉ亚单位，由线粒体dna编码。本专利技术根据牡蛎线粒体细胞色素c氧化酶亚基ｉ基因序列，使用biodet软件和primer express 3.0 软件进行了序列分析和引物、探针设计。该基因序列通过对genebank登录的贝类其他动物核酸序列的比对获得，并对设计出的引物和探针进行了在线blast比对查询，可保证牡蛎成分的检出。本专利技术采用实时荧光pcr技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的加工食品和饲料中牡蛎成分的检测。
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1. 一种牡蛎成分快速检测试剂盒，其特征在于，含有的试剂如下：
2. 一种检测食品和饲料中牡蛎成分的方法，其特征在于，依次包括下列步骤：
【技术特征摘要】
1. 一种牡蛎成分快速检测试剂盒，其特征在于，含有的试剂如下：
【专利技术属性】
技术研发人员：孙敏，张倩，高宏伟，李瑞，
申请(专利权)人：青岛海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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