【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人dmd基因51号外显子的sgrna及其载体和应用。
技术介绍
1、杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，dmd)，也称假性肌肥大营养不良，是一种由dmd基因编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)突变所致的x染色体隐性遗传疾病。女孩为携带者，男孩发病，患病率约为1/3500。dmd基因是目前已知最大的人类基因之一，全长约2.4mb，含有79个外显子和78个内含子，cdna长14kb。dmd突变主要以大片段缺失和重复突变为主，其中外显子2-20和45-55为两个热点突变区域。dmd基因突变导致功能性dystrophin蛋白缺失，引起肌细胞膜脆性增加和肌细胞变性坏死，导致患者肌无力和丧失行走能力，最终因膈肌功能不全、心脏和呼吸衰竭而过早死亡。目前国内外针对dmd均无彻底有效的治疗方法，临床上的治疗方案大多只能缓解症状，无法阻止肌肉组织功能的持续丧失。在过去的许多年里，科学家们已经尝试了许多治疗方法，如用各种抗炎激素药物治疗，通过重组腺相关病毒(aav)递送截短的mini-/micro-dystrophin蛋白，及用反义寡核苷酸和小分子药物实现外显子跳跃等。这些方法都存在一些不足，如长期服用激素类药物具有明显的副作用，且治标不治本；通过aav递送的截短mini-/micro-dystrophin蛋白功能不全或不明确，且存在外源性免疫排斥反应的风险；用反义寡核苷酸和小分子药物实现的外显子跳跃治疗方法需要长期给药，且药价昂贵。因此，开发安
2、crispr/cas基因编辑技术能从dmd基因层面精准纠正突变，从而使肌细胞持久的产生dystrophin蛋白，因此具有治疗dmd的巨大潜力。应用aav递送crispr/cas组分，在各种dmd模型包括mdx小鼠、犬和猪模型，还有人心肌细胞中已经成功恢复了dystrophin蛋白的表达，为dmd的临床治疗带来了希望。在进行临床试验之前，动物模型对于评估治疗方法的安全性和有效性非常重要。与猪和狗相比，灵长类动物在遗传背景、生理和行为等方面与人类更为相似，是评估dmd治疗方法有效性和安全性的理想动物模型。
3、现有技术采用aav递送crispr/spcas9基因编辑系统，针对dmd基因51号外显子设计单个或者双个sgrnas，诱导dna双链断裂并通过非同源末端连接(nhej)修复，纠正dmd基因的阅读框，使其表达有一定功能的dystrophin蛋白。然而，由于spcas9蛋白(1368个氨基酸)较大，加上sgrna及其他功能原件将超出aav载体的包载能力(＜4.7kb)，因此需要双载体进行递送，导致效率较低，而且需要的病毒量较大，这使得安全风险和治疗费用大大增加。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人dmd基因51号外显子的sgrna及其载体和应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人dmd基因51号外显子的sgrna，所述sgrna为human-sgrna1ex51、human-sgrna2ex51、human-sgrna3ex51、monkey-sgrna1ex51，monkey-sgrna2ex51，monkey-sgrna3ex51，和monkey-sgrna4ex51，中的一种；
3、human-sgrna1ex51是针对人dmd基因51号外显子设计的sgrna，核苷酸序列如seqid no.1所示，具体为：gtaacagtctgagtaggagc。
4、human-sgrna2ex51是针对人dmd基因51号外显子设计的sgrna，核苷酸序列如seqid no.2所示，具体为：gtgacacaacctgtggttac。
5、human-sgrna3ex51是针对人dmd基因51号外显子设计的sgrna，核苷酸序列如seqid no.3所示，具体为：agactgttactctggtgaca。
6、monkey-sgrna1ex51是针对猕猴dmd基因51号外显子设计的sgrna，核苷酸序列如seq id no.4所示，具体为：taacagtctgactaggagct。
7、monkey-sgrna2ex51是针对猕猴dmd基因51号外显子设计的sgrna，核苷酸序列如seq id no.5所示，具体为：gtaacagtctgactaggagc。
8、monkey-sgrna3ex51是针对猕猴dmd基因51号外显子设计的sgrna与seq id no.2相同，核苷酸序列如seq id no.6所示，具体为：gtgacacaacctgtggttac。该序列与seq idno.2完全相同。
9、monkey-sgrna4ex51是针对猕猴dmd基因51号外显子设计的sgrna与seq id no.3相同，核苷序列如seq id no.7所示，具体为：agactgttactctggtgaca。该序列与seq id no.3完全相同。
10、基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种载体，所述载体为将所述的sgrna克隆至质粒上，并进行病毒包装。
11、上述的载体，进一步的，所述质粒为paav-cas12imax-u6-crrna-sgrna质粒。
12、上述的载体，进一步的，所述病毒为myoaav。
13、基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种所述的载体用于制备治疗dmd的药物。
14、上述的应用，进一步的，所述用于治疗dmd药物为用于治疗dmd基因50号外显子缺失引起的dmd的药物、用于治疗dmd基因49-50号外显子缺失引起的dmd的药物、用于治疗dmd基因48-50号外显子缺失引起的dmd的药物、用于治疗dmd基因47-50号外显子缺失引起的dmd的药物或用于治疗dmd基因45-50号外显子缺失引起的dmd的药物。
15、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
16、(1)本专利技术提供了一种靶向dmd基因51号外显子用于治疗dmd的sgrna。以dmd基因51号外显子为靶点可治疗大约13％的dmd患者。因此，我们设计了一种人猴共用的、肌肉特异性的单切(single-cut)治疗策略。该策略通过单个或两个sgrnas靶向dmd基因51号外显子5'-ag-3'的剪接受体位点，能够实现跳跃或重构dmd基因51号外显子，恢复阅读框，从而恢复dystrophin蛋白的表达。该策略在dmd模型猴上取得成功后，可直接应用于患者。
17、(2)本专利技术提供了一种肌肉靶向性myoaav递送的cas12imax-human-sgrna2ex51单载体。我们采用了最近开发的肌肉特异性aav病毒血清型myoaav，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为Human-sgRNA1Ex51，Human-sgRNA2Ex51，Human-sgRNA3Ex51，Monkey-sgRNA1Ex51，Monkey-sgRNA2Ex51，Monkey-sgRNA3Ex51，Monkey-sgRNA4Ex51中的一种；
2.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的sgRNA分别克隆至质粒上，并进行病毒包装。
3.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的sgRNA共同构建到同一个质粒上，并进行病毒包装。
4.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述质粒为pAAV-Cas12iMax-U6-crRNA-sgRNA质粒。
5.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述病毒为MyoAAV。
6.如权利要求1所述的sgRNA或者如权利要求2-3任一所述的表达载体在制备用于治疗DMD药物中的应用。
7.根据
...【技术特征摘要】
1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人dmd基因51号外显子的sgrna，其特征在于，所述sgrna为human-sgrna1ex51，human-sgrna2ex51，human-sgrna3ex51，monkey-sgrna1ex51，monkey-sgrna2ex51，monkey-sgrna3ex51，monkey-sgrna4ex51中的一种；
2.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的sgrna分别克隆至质粒上，并进行病毒包装。
3.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的seq id no.1和seq id no.2的sgrna共同构建到同一个质粒上，并进行病毒包装。
4.根据权利要求2或3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永昌，白绕仙，任帅伟，肖浦豪，郭文婷，张婷，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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