【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原微生物和耐药基因检测，具体涉及用于检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合及试剂盒。
技术介绍
1、尿路感染（urinary tract infection, uti）是社区与医院最常见的感染性疾病之一。由尿路病原菌入侵尿道导致的尿路感染波及了全球超过1.5亿次人口，其复发率之高和日趋加重的抗菌药物耐药正成为社会公共卫生的负担之一。由于女性的尿道短宽直，会阴部和肛门靠近尿道口，细菌更容易上升到女性膀胱；阴道细菌定植频繁，并且因脱垂、尿潴留等因素进而干扰尿液流动和膀胱排空；由于解剖结构和激素水平的变化，妊娠女性更易罹患尿路感染，这些可能是导致女性尿路感染风险增加相关的诱因之一。此外，65岁以上女性由于整个生命周期中生理、激素和免疫变化等原因，尿路感染的几率会随着年龄的增长而增加。
2、我国女性尿路感染的病原菌以革兰氏阴性杆菌为主，首位是大肠埃希菌是首位的病原菌，其次是革兰阳性球菌、克雷伯菌及假单胞菌属，后者在妊娠期和绝经后的女性尿路感染尤为常见。感染病原菌多为单一菌种，但在复杂性尿路感染中可见两种以上细菌（中国女性尿路感染诊疗专家共识[j].中华医学杂志,2017,97 (36): 2827-2832.）。我国临床尿路感染的诊断金标准为清洁中段尿液细菌培养鉴定及药敏分析，鉴于培养鉴定流程整体耗时较长（约3-5天），因此临床医生在获得药敏试验结果前通常经验性采用抗菌治疗。由于临床上抗生素的广泛应用，如氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等，导致尿路感染的病原微生物的分布和发生变化，并诱导耐
3、目前，常用的针对尿路感染病原微生物核酸和耐药基因的检测方法主要是全自动微生物鉴定及药敏鉴定仪或核酸检测技术。自动鉴定仪检测菌种范围广、操作简便，但需要分离培养出病原微生物纯单菌落才可上机检测，而这使得实验室快速检测病原微生物及明确耐药性这一目标难以实现。核酸检测技术主要分为高通量测序技术和荧光pcr法。在目前公开的检测尿路感染病原微生物核酸和耐药基因文献中，高通量测序技操作繁琐、检测成本高，且对操作技术有较高要求；而荧光pcr法是目前核酸检测技术市场中最为成熟、占有率最高的检测手段，由于其灵敏度高、特异性好、成本可控的特点，在病原微生物检测领域得到广泛应用。但目前荧光pcr法能检测到的病原菌种类和耐药基因较少，且一管检测的病原菌种类和耐药基因有限，无法进行广泛的病原菌和耐药基因筛查。
4、综上，为了能够快速且全面的检测患者泌尿系统的感染病原微生物及其耐药性，更好指导临床合理用药，急需迫切开发一款覆盖面广泛的新技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术中对尿路感染病原微生物、耐药基因检测覆盖面窄的问题，提供检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合及试剂盒，能同时准确区分多种尿路感染病原微生物、耐药基因，只需常规荧光定量pcr仪即可完成检测，检测覆盖面宽、检测成本低、灵敏度好。
2、本专利技术技术方案详述如下：
3、第一方面，本专利技术提供了检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合，所述病原微生物包括大肠埃希菌（ec）、肺炎克雷伯菌（kpn）、铜绿假单胞菌（pa）、奇异变形杆菌（pm）、阴沟肠杆菌（ecc）、鲍曼不动杆菌（ab）、屎肠球菌（efm）、粪肠球菌（efs）、无乳链球菌（gbs）、金黄色葡萄球菌（sa）和白色假丝酵母菌（ca），检测引物和探针的核苷酸序列如seq id no:1~33所示；
4、其中，所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
5、上述至少6种病原微生物的检测引物和探针能置于一管中供样本检测，可以检测至少一种病原微生物，也可同时用于上述所有病原微生物的检测。一管中同一tm值范围内不同病原微生物检测探针标记的荧光基团不同。
6、可选或优选的，所述耐药基因包括ctx-m-1、ctx-m-9、shv、tem、cmy-2、kpc、ndm、vim、imp、oxa-48、oxa-23、vana、vanb、meca和mecc，检测引物和探针的核苷酸序列如seq idno:34~78所示；
7、其中，所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
8、上述至少6种耐药基因的检测引物和探针能置于一管中供样本检测，可以检测至少一种耐药基因，也可同时用于上述所有耐药基因的检测。一管中同一tm值范围内不同耐药基因检测探针标记的荧光基团不同。
9、可选或优选的，还包括内参基因gapdh的检测引物和探针，核苷酸序列如seq idno: 79~81所示；
10、gapdh检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
11、第二方面，本专利技术提供了检测尿路感染病原微生物、耐药基因的试剂盒，其含有以上任一所述检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合。
12、可选或优选的，所述病原微生物检测引物探针组合置于一管内，耐药基因检测引物探针组合置于另一管内。
13、可选或优选的，还包括pcr反应液，所述pcr反应液每一人份由浓度1u/μl多重扩增的taq dna聚合酶0.5~1 μl、浓度10 mm的dntps 1~5 μl、浓度5 mm 的mg2+2~5μl、10×dna聚合酶buffer 2.5 μl和纯化水补足15 μl组成。
14、可选或优选的，还包括尿液粗提液，所述尿液粗提液每一人份由50mm tris hclph 8.0，体积分数1%的triton x-100，2mm edta，50mm naoh，体积分数10%的甘油和余量的纯化水组成。
15、本专利技术中，所述同一tm值范围，是指不同的病原微生物检测引物tm值之间有重叠，不同的耐药基因检测引物tm值之间有重叠。例如，耐药基因meca和耐药基因oxa-48的检测引物tm值分别为55.09~57.92、54.26~57.53，二者有重叠部分为55.09~57.53，则二者属于同一tm值范围，二者对应的检测探针标记的荧光基团应当不同。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
17、1、可大批量高覆盖率检测不同的病原微生物、耐药基因
18、本专利技术的检测引物和探针，能够实现一管内批量同时检测至少一种病原微生物、一管内批量同时检测至少一种耐药基因，一管内批量同时至多检测11种病原微生物、一管内批量同时检测至少15种耐药基因。通过在探针序列增加mgb（minor groove binder, 小沟结合物）修饰和锁核酸（locked nucleic acid，lna）修饰，提高探针tm值，增加探针与模板杂交的结合效率本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，其特征在于，所述病原微生物包括大肠埃希菌（EC）、肺炎克雷伯菌（KPN）、铜绿假单胞菌（PA）、奇异变形杆菌（PM）、阴沟肠杆菌（ECC）、鲍曼不动杆菌（AB）、屎肠球菌（EFM）、粪肠球菌（EFS）、无乳链球菌（GBS）、金黄色葡萄球菌（SA）和白色假丝酵母菌（CA），检测引物和探针的核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，其特征在于，所述耐药基因包括CTX-M-1、CTX-M-9、SHV、TEM、CMY-2、KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48、OXA-23、vanA、vanB、mecA和mecC，检测引物和探针的核苷酸序列如下：
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，核苷酸序列如下：
4.检测尿路感染病原微生物、耐药基因的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1~3任一所述检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL多重扩增的Taq DNA聚合酶0.5~1 μL、浓度10 mM的dNTPs 1~5 μL、浓度5mM 的Mg2+ 2~5μL、10×DNA聚合酶buffer 2.5 μL和纯化水补足15 μL组成。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括尿液粗提液，所述尿液粗提液每一人份由50mM Tris HCl pH 8.0，体积分数1%的Triton X-100，2mM EDTA，50mM NaOH，体积分数10%的甘油和余量的纯化水组成。
...【技术特征摘要】
1.检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，其特征在于，所述病原微生物包括大肠埃希菌（ec）、肺炎克雷伯菌（kpn）、铜绿假单胞菌（pa）、奇异变形杆菌（pm）、阴沟肠杆菌（ecc）、鲍曼不动杆菌（ab）、屎肠球菌（efm）、粪肠球菌（efs）、无乳链球菌（gbs）、金黄色葡萄球菌（sa）和白色假丝酵母菌（ca），检测引物和探针的核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，适用于高分辨率熔解曲线分析，其特征在于，所述耐药基因包括ctx-m-1、ctx-m-9、shv、tem、cmy-2、kpc、ndm、vim、imp、oxa-48、oxa-23、vana、vanb、meca和mecc，检测引物和探针的核苷酸序列如下：
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，还包括内参基因gapdh的检测引物和探针，核苷酸序列如下：
4.检测尿路...
【专利技术属性】
技术研发人员：王林海，刘沛，温相慧，
申请(专利权)人：北京起源聚禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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