【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学的，尤其是涉及一种引物及srap分子标记的大蒜品种鉴定方法和提取dna装置。
技术介绍
1、大蒜属于百合科葱属植物的地下鳞茎，是一种重要的经济作物，其鳞茎、花茎、嫩叶均可食用，是重要的食药两用植物，广泛栽培于世界各地。我国大蒜种植历史悠久，品种资源丰富，主要分布在山东、江苏、河南、陕西、四川、广西、云南等地区，种植面积和产量均位于世界第一。
2、大蒜作为无性繁殖作物，在不同地理位置的生态环境下，通过长期的定向培育和人为选择，形成了丰富的种质资源，因而在市场上有多种多样的大蒜品种，但是不同的大蒜品种具有不同的风味和口感，由于地域的原因，每个人之间的饮食习惯各不相同，对于各个品种的大蒜的喜爱程度也各不相同，因此，获得一种能有效鉴别大蒜品种的方法具有重要意义。
3、近些年来，srap分子标记技术已经应用于大蒜遗传多样性研究中。刊名为《种子》的期刊在2021年第7期报道了一篇名为“基于srap标记的大蒜种质资源遗传多样性分析”的文献，通过采用srap分子标记技术从而对18个大蒜群体的遗传多样性进行分析，用popgene32软件计算遗传多样性参数，并采用ntsys pc21-2软件进行种质间的upgma聚类分析和基于遗传一致度的群体间聚类分析。
4、刊名为《分子植物育种》的期刊在2018年第23期报道了一篇名为“大蒜野生近缘种的srap反应体系建立和优化”的文献，本文献通过以新疆大蒜野生近缘种为材料，采用正交实验法，对其反应体系进行4因素4水平优化试验，从而便于进一步开展大蒜野生
5、但是，迄今为止，未见报道srap分子标记应用于大蒜品种鉴定领域中。
技术实现思路
1、为了更加高效、准确的鉴别不同品种的大蒜，本专利技术提供一种引物及srap分子标记的大蒜品种鉴定方法和提取dna装置。
2、第一方面，本专利技术提供了一种引物，采用如下的技术方案：
3、一种引物共22对，所述22对引物均包括正向引物和反向引物，22对引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如seq id no.1至seq id no.44所示：
4、
5、通过采用上述技术方案，22对引物组合具有结果稳定、条带清晰、多态性好等优点，是大蒜的特异性引物。
6、可选的，所述22对srap分子标记引物在鉴定不同的大蒜品种中的应用。
7、通过采用上述技术方案，利用22对引物组合，可进行特异性扩增，进而可得到条带图谱，从而可以区分、鉴别不同的大蒜品种，进而能够广泛应用于不同大蒜品种的鉴定。
8、第二方面，本专利技术提供了一种srap分子标记的大蒜品种鉴定方法，采用如下的技术方案：
9、一种srap分子标记的大蒜品种鉴定方法，包括如下步骤：
10、s1、在培养室穴盘内种植多份大蒜品种，待植株长到幼苗期时，摘取单株的幼嫩叶片冷冻保存；
11、s2、采用改良ctab法提取大蒜品种的基因组dna；并检测dna的浓度和纯度；
12、s3、选用10条正向引物和13条反向引物随机组合成130对srap引物；建立一套srap-pcr分子标记扩增体系和扩增程序，扩增产物用凝胶电泳检测；
13、s4、在多份大蒜品种中任意选择两个品种从而对步骤s3中的130对srap引物进行初步筛选，初步筛选后可得出50对引物组合；通过利用筛选出的50对引物组合对大蒜品种进行多态性条带分析，进而筛选出22对核心引物，筛选出的22对核心引物可区分大蒜品种；
14、s5、指纹图谱的建立：以步骤s2中多份大蒜品种的其中一个品种所提取的dna作为模板，将22对核心引物按照步骤s3建立的srap-pcr分子标记扩增体系进行扩增所得到的条带图谱即为这个品种的指纹图谱；从多份大蒜种质资源中鉴别该品种时，通过使用本方法，能够获得所有品种的指纹图谱，通过一一对比，与该品种的指纹图谱相一致的，即可鉴定此大蒜为该品种。
15、所述步骤s2中采用改良ctab法提取大蒜品种的基因组dna，包括如下步骤：
16、s21、将0.3g鲜叶和1粒钢珠放入2ml离心管中，放入液氮中冷冻，冷冻后放入组织研磨器中研磨，研磨后加入1.5ml新鲜配制的提取缓冲液[0.35m glucose、0.1m tris-hcl（ph8）、5mm na-edta（ph8）、2% pvp、1%（v/v）β-me、dd-water]，涡旋混匀，冰浴保存10min，10000rpm离心10min（4℃），弃上清；
17、s22、于沉淀中加入0.9ml 65℃预热的裂解缓冲液[1.4m nacl、0.1m tris-hcl（ph8）、20mm na-edta（ph8）、2% ctab、2% pvp、1%（v/v）β-me、dd-water]，涡旋混匀，65℃水浴30min；
18、s23、加入0.9ml氯仿：异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心10min（15℃），将上清转入新的2ml离心管中，加0.6体积（1ml）的预冷的异丙醇，翻转30次，混匀，静置10min，10000rpm，离心10min（室温），弃上清，于沉淀中加入0.6 ml 70%的乙醇洗涤，10000rpm离心5min，倒掉上清液，通风干燥20min；
19、s24、加0.5mlte缓冲液[10mm tris-hcl、1mm edta（ph8）、dd-water]溶解，65℃培养10—30min，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；
20、s25、上清液转入新的2ml离心管中，加0.1体积的3m醋酸钠(ph 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min，弃上清液，加0.5ml70%乙醇洗dna小团，转入1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min，弃上清液，自然通风干燥dna小团；
21、s26、加200ulte缓冲液[10mm tris-hcl、1mm edta（ph8）、dd-water]溶解dna（4℃，30min以上），并保存。
22、通过采用上述技术方案，对于某一个大蒜品种，以该品种的dna作为模板，利用筛选出的22对特异性srap-pcr核心引物，经pcr扩增后能得到该品种的指纹图谱，对于每一个大蒜品种都可以获得一个特异性的指纹图谱，进而能够区分和鉴别大蒜品种；由于筛选出来的22对引物组合具有结果稳定、条带清晰、多态性好的优点，因此，经过pcr扩增后得到的指纹图谱能够高效、准确的区分和鉴别大蒜品种，从而解决了使用常规方法鉴定大蒜品种困难、鉴别不准确的问题，并且该srap分子标记鉴定方法还具有高共显性、操作简单、结果稳定等优点。
23、可选的，所述的步骤s3中srap-pcr分子标记扩增采用20μlpcr反应体系，10×b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物，其特征在于：一种引物共22对，所述22对引物均包括正向引物和反向引物，22对引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.44所示：
2.根据权利要求1所述的一种引物，其特征在于：所述22对SRAP分子标记引物在鉴定不同的大蒜品种中的应用。
3.一种SRAP分子标记的大蒜品种鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
4. 根据权利要求3所述的一种SRAP分子标记的大蒜品种鉴定方法，其特征在于：所述的步骤S3中SRAP-PCR分子标记扩增采用20μlPCR反应体系，10×Buffer 2μl、Mg2+ 2 mmol/L、Taq 聚合酶2 U、dNTPs 0.2 mmol /L、模板DNA约40 ng、引物0.6 μmol /L，无菌超纯水补足20 ml；所述的步骤S3中PCR扩增程序为，94℃预变性5min，94℃变性60S、35℃复性60S和72℃延伸60S，共5个循环，94℃变性60S、50℃复性60S和72℃延伸60S，共35个循环，最后72℃延伸10min；所述的步骤S3中扩增产物用凝胶电泳进行
5.一种提取DNA装置，其特征在于：包括提取机构（300）、抽取机构（400）、保温机构（500）、干燥机构（600）、夹持机构（200）、第一箱体（100）、第一箱盖（110），所述提取机构（300）、抽取机构（400）、保温机构（500）、干燥机构（600）依次设置在第一箱体（100）的底部，所述夹持机构（200）设置在第一箱体（100）内部的顶端，所述第一箱盖（110）设置在第一箱体（100）的顶部，且第一箱盖（110）可罩设住所述第一箱体（100）；
6.根据权利要求5所述的一种提取DNA装置，其特征在于：所述夹持机构（200）包括第一导轨（210）、第一移动横梁（220）、第二驱动组件（270）、第二导轨（230）、第三驱动组件（280）、机械臂（240）、第二伸缩气缸（250）、机械夹手（260），所述第一导轨（210）设置在第一箱体（100）顶部的内壁上，所述第一移动横梁（220）通过第二驱动组件（270）的驱动滑动连接在第一导轨（210）上，所述第二导轨（230）设置在第一移动横梁（220）上，所述机械臂（240）通过第三驱动组件（280）的驱动滑动连接在第二导轨（230）上，所述机械臂（240）通过第二伸缩气缸（250）的驱动可沿竖直方向滑动连接在所述第三驱动组件（280）上，所述机械夹手（260）设置在机械臂（240）朝向第一箱体（100）的底部的一端。
7.根据权利要求6所述的一种提取DNA装置，其特征在于：所述抽取机构（400）包括放置室（401）、第一离心管架（402）、吸管（407）、真空泵（409）、第一管路（410）、第二移动横梁（412）、第三导轨（413）、第四驱动组件（415）、第三伸缩气缸（414）、第五驱动组件（416），所述放置室（401）设置在第一箱体（100）的底部，所述第一离心管架（402）设置在所述放置室（401）的内部，且第一离心管架（402）上开设有用于放置离心管的第三通孔（4021），所述放置室（401）的内部开设有废液槽（403），所述放置室（401）上活动设置有盖板（405），且盖板（405）可罩设住废液槽（403），所述放置室（401）的内部开设有清洗槽（404），且清洗槽（404）中填充有清洗介质，所述第二移动横梁（412）通过第四驱动组件（415）的驱动滑动连接在第一导轨（210）上，所述第三导轨（413）设置在所述第二移动横梁（412）上，所述第三伸缩气缸（414）通过第五驱动组件（416）的驱动滑动连接在第三导轨（413）上，所述真空泵（409）设置在第一箱体（100）一侧的内壁上，所述吸管（407）设置在第三伸缩气缸（414）上，且吸管（407）与所述真空泵（409）的进气口相连通，所述第一管路（410）的一端与真空泵（409）的出气口相连通，所述第一管路（410）的另一端可与废液槽（403）相连通。
8.根据权利要求7所述的一种提取DNA装置，其特征在于：所述保温机构（500）包括第三箱体（501）、第三箱盖（502）、导热板（506）、第二离心管架（507）、加热管（508）、压缩机（509）、温度传感器（510）、密封组件（511），所述第三箱体（501）设置在第一箱体（100）的底部，所述第三...
【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于：一种引物共22对，所述22对引物均包括正向引物和反向引物，22对引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如seq id no.1至seq id no.44所示：
2.根据权利要求1所述的一种引物，其特征在于：所述22对srap分子标记引物在鉴定不同的大蒜品种中的应用。
3.一种srap分子标记的大蒜品种鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
4. 根据权利要求3所述的一种srap分子标记的大蒜品种鉴定方法，其特征在于：所述的步骤s3中srap-pcr分子标记扩增采用20μlpcr反应体系，10×buffer 2μl、mg2+ 2 mmol/l、taq 聚合酶2 u、dntps 0.2 mmol /l、模板dna约40 ng、引物0.6 μmol /l，无菌超纯水补足20 ml；所述的步骤s3中pcr扩增程序为，94℃预变性5min，94℃变性60s、35℃复性60s和72℃延伸60s，共5个循环，94℃变性60s、50℃复性60s和72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min；所述的步骤s3中扩增产物用凝胶电泳进行检测为，配置6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳槽上的每个泳道上样量为8μl，电泳缓冲液为0.5×tbe，150 v预电泳30min，然后用200v恒压电泳2.5 h，停止电泳并用0.1％硝酸银染色，在观察灯箱上拍照记录试验结果。
5.一种提取dna装置，其特征在于：包括提取机构（300）、抽取机构（400）、保温机构（500）、干燥机构（600）、夹持机构（200）、第一箱体（100）、第一箱盖（110），所述提取机构（300）、抽取机构（400）、保温机构（500）、干燥机构（600）依次设置在第一箱体（100）的底部，所述夹持机构（200）设置在第一箱体（100）内部的顶端，所述第一箱盖（110）设置在第一箱体（100）的顶部，且第一箱盖（110）可罩设住所述第一箱体（100）；
6.根据权利要求5所述的一种提取dna装置，其特征在于：所述夹持机构（200）包括第一导轨（210）、第一移动横梁（220）、第二驱动组件（270）、第二导轨（230）、第三驱动组件（280）、机械臂（240）、第二伸缩气缸（250）、机械夹手（260），所述第一导轨（210）设置在第一箱体（100）顶部的内壁上，所述第一移动横梁（220）通过第二驱动组件（270）的驱动滑动连接在第一导轨（210）上，所述第二导轨（230）设置在第一移动横梁（220）上，所述机械臂（240）通过第三驱动组件（280）的驱动滑动连接在第二导轨（230）上，所述机械臂（240）通过第二伸缩气缸（250）的驱动可沿竖直方向滑动连接在所述第三驱动组件（280）上，所述机械夹手（260）设置在机械臂（240）朝向第一箱体（100）的底部的一端。
7.根据权利要求6所述的一种提取dna装置，其特征在于：所述抽取机构（400）包括放置室（401）、第一离心管架（402）、吸管（407）、真空泵（409）、第一管路（410）、第二移动横梁（412）、第三导轨（413）、第四驱动组件（415）、第三伸缩气缸（414）、第五驱动组件（416），所述放置室（401）设置在第一箱体（100）的底部，所述第一离心管架（402）设置在所述放置室（401）的内部，且第一离心管架（402）上开设有用于放置离心管的第三通孔（4021），所述放置室（401）的内部开设有废液槽（403），所述放置室（401）上活动设置有盖板（405），且盖板（405）可罩设住废液槽（403），所述放置室（401）的内部开设有清洗槽（404），且清洗槽（404）中填充有清洗介质，所述第二移动横梁（41...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红耀，张彦波，温国昌，王振武，张清华，
申请(专利权)人：邯郸市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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