一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法技术

本发明专利技术涉及一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法，该方法首先将新鲜沙棘枝的粗提液经丙酮分级沉淀后，根据ＳＯＤ对抑制剂的敏感性不同判断为铜／锌ＳＯＤ；然后将铜／锌ＳＯＤ粗制品吸附在ＤＥＡＥ－５２层析柱上，不经洗脱分离，直接用活化的ｍＰＥＧ－２００００对吸附在柱上的铜／锌ＳＯＤ进行化学耦合修饰，最后通过特异性洗脱分离获得ＰＥＧ－铜／锌ＳＯＤ，从而实现了沙棘中铜／锌ＳＯＤ分离纯化和修饰过程同步完成。本发明专利技术不但解决了目前蛋白质的分离纯化和修饰是两个相互独立的过程而引起的蛋白质变性失活，过程操作步骤多、周期长等长期困扰的问题，而且修饰后的ｍＰＥＧ－铜／锌ＳＯＤ的活力比未修饰前有所提高，具有安全性高、稳定性更好的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶的制备与修饰过程同步完成的方法，尤其涉及一种沙棘铜/锌 SOD的制备与修饰过程同步完成的方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶是一类清除自由基的蛋白酶，能够平衡机体的氧自由基，从而避 免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，是生物体防御氧毒性的关键。在 抗防辐射损伤、预防衰老、治疗自身免疫性疾病、防治各种炎症和肿瘤以及再灌流损伤等方 面也具有重要作用。SOD基于金属辅基不同，可分为铜锌超氧化物歧化酶(铜/锌SOD)、锰超氧化物歧 化酶、铁超氧化物歧化酶三种类型。铜锌超氧化物歧化酶是由二个亚基组成的金属酶，每个 亚基含一个铜原子和一个锌原子，故称“铜锌超氧化物歧化酶”，它是一种重要的生化试剂， 也是一种很有前途的药用酶，又是一种人体内自由的基的清除剂，具有专一性强、时效高等 优点。同时，铜锌超氧化物歧化酶也存在着容易被机体快速消除，不稳定，易被酶水解等问 题。而化学修饰的目的之一就是保护蛋白质，修饰基团可有效地提高其稳定性，阻止蛋白水 解酶与蛋白质骨架本身的接触，从而阻止蛋白质的降解，减小其免疫原性等。化学修饰剂之 一的单甲醚聚乙二醇(mPEG-20000)具有完全的生物相容性及亲水性，没有抗原性及免疫 原性，而且在耐热、耐酸碱及抗蛋白酶水解能力方面明显优于天然酶，特别是大大延长在体 内停留时间。长期实验也表明其没有毒性，由于修饰产物其独特的物理化学性质及生物学 功能，对蛋白质进行PEG化修饰已成为化学修饰法中较为成功的一种方法。沙棘又名沙枣、醋柳果、黑刺、酸刺，是胡颓子科植物沙棘(Hippophaerhamnoides L.)。沙棘分布范围极广，中国拥有世界上最丰富的沙棘资源，是防风固沙的“先锋树种”，具 有耐寒、耐旱、耐瘠薄及迅速繁殖成林的优良生态学特征。中国专利申请号92109883公开 了由沙棘提取分离超氧化物歧化酶工艺，采用的方式主要是用氯仿-乙醇混合溶剂，加入 钱盐使SOD分离，再精制。该方法为SOD制备开辟新途径。中国专利申请号94112613公开 了沙棘超氧物歧化酶及小分子抗氧化复合物，其中用天然沙棘浆果或叶为原料，加入磷酸 缓冲液，低温冷冻勻降，热沉淀、过滤、离心分离而得复合物。酶纯度不高。中国专利申请号 200510011365公开了从沙棘鲜嫩枝叶提取蛋白质、总黄酮和超氧化物歧化酶的方法，主要 采用盐析法。中国专利申请号200810045010公开了一种沙棘铜/锌超氧化物歧化酶及其 制备，主要离心取沙棘果汁，加入有机溶剂乙醇沉淀，膜过滤，浓缩，冷冻干燥而得，制备方 法简单。以上方法都主要是从沙棘果、叶或枝中提取或制备SOD或铜/锌SOD的方法。对沙 棘中提取、制备超氧化物歧化酶的提供了多种方法，但是，这些方法都未能解决所制备SOD 的半衰期短、稳定性差、易被蛋白酶水解等缺点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作步骤少、周期短的沙棘铜/锌SOD的3制备与修饰过程同步完成的方法。为解决上述问题，本专利技术所述的一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成 的方法，包括以下步骤(1)将洁净的沙棘枝在0 4°C温度下粉碎后，按1 5 1 15的料液重量体 积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；(2)将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其体积的0. 3 0. 4倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过 滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0 4°C温度下，用料液重量体积比为1 2 1 5的磷酸缓冲液对所述 超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)选择KCN和H2O2作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂 的敏感性不同来判断所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品为铜锌超氧化物歧化酶粗制品；(6)将所述铜锌超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE-52层析柱，并用5BV 7BV的Tris-HCl缓冲液平衡；其中Tris-HCl缓冲液的pH值为7. 4 8. 6，浓度为25mmol/ L 60mmol/L ；(7)在所述装有铜锌超氧化物歧化酶粗制品的DEAE-52层析柱上，用溶于的硼 酸-硼砂缓冲液的活化好的分子量为20000的单甲醚聚乙二醇来修饰铜锌超氧化物歧化 酶；(8)用pH值为7. 4 8. 6、浓度为15mmol/L 30mmol/L的Tris-HCl缓冲液对所 述修饰铜锌超氧化物歧化酶的DEAE-52层析柱进行浓度为0. lmol/L 0. 4mol/L的NaCl 梯度洗脱，得到洗脱液，该洗脱液经电泳鉴定修饰酶后，收集修饰酶，并测定所述修饰酶的 活力即可。所述步骤(1)和(4)中磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L，且其pH值为7. 8。所述步骤(6)中DEAE-52层析柱的平衡是指采用pH值为7. 4 8. 6、浓度为 25mmol/L 60mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液平衡。所述步骤(7)中的活化好的分子量为20000的单甲醚聚乙二醇是指分子量为20000的单甲醚聚乙二醇用三聚氯氰在苯中进行反应活化所得。所述步骤(7)中的硼酸-硼砂缓冲液的浓度为45mmol/L 60mmol/L，pH值为 8. 5 9. 5。本专利技术与现有技术相比具有以下优点1、沙棘铜锌超氧化物歧化酶分离纯化和修饰过程同步完成。本专利技术利用层析分 离技术吸附，先不经洗脱步骤，直接对吸附在层析分离介质上的铜锌超氧化物歧化酶进行 化学修饰，再通过特异性洗脱获得修饰蛋白。这种方法不但解决了目前蛋白质的分离纯化 和修饰是两个相互独立的过程而引起的蛋白质变性失活，过程操作步骤多、周期长等长期 困扰的问题，而且也保证了所获得的铜锌超氧化物歧化酶具有高活性，使得其在多肽、蛋白 质、药用酶等生化药物的生产、研究和临床上有较高的应用价值。2、经测试，本专利技术获得的PEG-铜锌超氧化物歧化酶具有良好溶解性，比铜锌SOD 酶的溶解度高82%，且不易被水解酶降解，例如加入胃蛋白酶4小时后，活力保留仍为 87. 1%,同样条件下，铜/锌SOD的活力仅为43. 6%；加入胰蛋白酶4小时后，PEG-铜锌SOD活力保留为92.4%，而铜锌SOD活力仅为36.7%。PEG-铜锌SOD热稳定性也显著提高，铜 锌SOD在70°C保温5小时后活力保留11. 9%，而PEG-铜锌SOD活力保留45. 2%。3、本专利技术操作步骤少、周期短。具体实施例方式实施例1 一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步 骤(1)摘取新鲜的沙棘枝用去离子水洗净，将洁净的沙棘枝在0°C 4°C下粉碎后， 按1 5的料液重量体积比加入浓度为50mmol/L、且其pH值为7. 8的磷酸缓冲液，并在该 温度下、功率为90W进行超声提取，超声每2分钟间断一次，共超声20分钟，得到提取液。(2)将提取液以4000rpm/min的速率离心20分钟，过滤，得到上清液。(3)在上清液中由少到多，分三次加入其体积的0. 38倍的丙酮，置0 4°C的冰浴 中搅拌后，以4000rpm/min的速率离心40分钟，过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物。(4)在0 4°C温度下，用料液重量体积比为1 2的磷酸缓冲液对超氧化物歧化 酶沉淀物进行溶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步骤：　　（１）将洁净的沙棘枝在０～４℃温度下粉碎后，按１∶５～１∶１５的料液重量体积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；　　（２）将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；　　（３）在所述上清液中加入其体积的０．３～０．４倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；　　（４）在０～４℃温度下，用料液重量体积比为１∶２～１∶５的磷酸缓冲液对所述超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；　　（５）选择ＫＣＮ和Ｈ２Ｏ↓［２］作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂的敏感性不同来判断所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品为铜锌超氧化物歧化酶粗制品；　　（６）将所述铜锌超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的ＤＥＡＥ－５２层析柱，并用５ＢＶ～７ＢＶ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液平衡；其中Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液的ｐＨ值为７．４～８．６，浓度为２５ｍｍｏｌ／Ｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ；　　（７）在所述装有铜锌超氧化物歧化酶粗制品的ＤＥＡＥ－５２层析柱上，用溶于的硼酸－硼砂缓冲液的活化好的分子量为２００００的单甲醚聚乙二醇来修饰铜锌超氧化物歧化酶；　　（８）用ｐＨ值为７．４～８．６、浓度为１５ｍｍｏｌ／Ｌ～３０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液对所述修饰铜锌超氧化物歧化酶的ＤＥＡＥ－５２层析柱进行浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ～０．４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ梯度洗脱，得到洗脱液，该洗脱液经电泳鉴定修饰酶后，收集修饰酶，并测定所述修饰酶的活力即可。...

【技术特征摘要】
一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步骤(1)将洁净的沙棘枝在0～4℃温度下粉碎后，按1∶5～1∶15的料液重量体积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；(2)将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其体积的0.3～0.4倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0～4℃温度下，用料液重量体积比为1∶2～1∶5的磷酸缓冲液对所述超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)选择KCN和H2O2作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂的敏感性不同来判断所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品为铜锌超氧化物歧化酶粗制品；(6)将所述铜锌超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE 52层析柱，并用5BV～7BV的Tris HCl缓冲液平衡；其中Tris HCl缓冲液的pH值为7.4～8.6，浓度为25mmol/L～60mmol/L；(7)在所述装有铜锌超氧化物歧化酶粗制品的DEAE 52层析柱上，用溶于的硼酸 硼砂缓冲液的活化好的分子量为20000的单甲醚聚乙二醇来修饰铜锌超氧化物歧化酶；(8)用pH值为7.4～8.6、浓度为15mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：索有瑞，利毛才让，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：63[中国|青海]