一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法技术

本发明专利技术涉及一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法，该方法首先将新鲜沙棘枝的粗提液经丙酮分级沉淀后，根据ＳＯＤ对抑制剂的敏感性不同判断为铜／锌ＳＯＤ；然后将铜／锌ＳＯＤ粗制品吸附在ＤＥＡＥ－５２层析柱上，不经洗脱分离，直接用活化的ｍＰＥＧ－２００００对吸附在柱上的铜／锌ＳＯＤ进行化学耦合修饰，最后通过特异性洗脱分离获得ＰＥＧ－铜／锌ＳＯＤ，从而实现了沙棘中铜／锌ＳＯＤ分离纯化和修饰过程同步完成。本发明专利技术不但解决了目前蛋白质的分离纯化和修饰是两个相互独立的过程而引起的蛋白质变性失活，过程操作步骤多、周期长等长期困扰的问题，而且修饰后的ｍＰＥＧ－铜／锌ＳＯＤ的活力比未修饰前有所提高，具有安全性高、稳定性更好的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶的制备与修饰过程同步完成的方法，尤其涉及一种沙棘铜/锌 SOD的制备与修饰过程同步完成的方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶是一类清除自由基的蛋白酶，能够平衡机体的氧自由基，从而避 免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，是生物体防御氧毒性的关键。在 抗防辐射损伤、预防衰老、治疗自身免疫性疾病、防治各种炎症和肿瘤以及再灌流损伤等方 面也具有重要作用。SOD基于金属辅基不同，可分为铜锌超氧化物歧化酶(铜/锌SOD)、锰超氧化物歧 化酶、铁超氧化物歧化酶三种类型。铜锌超氧化物歧化酶是由二个亚基组成的金属酶，每个 亚基含一个铜原子和一个锌原子，故称“铜锌超氧化物歧化酶”，它是一种重要的生化试剂， 也是一种很有前途的药用酶，又是一种人体内自由的基的清除剂，具有专一性强、时效高等 优点。同时，铜锌超氧化物歧化酶也存在着容易被机体快速消除，不稳定，易被酶水解等问 题。而化学修饰的目的之一就是保护蛋白质，修饰基团可有效地提高其稳定性，阻止蛋白水 解酶与蛋白质骨架本身的接触，从而阻止蛋白质的降解，减小其免疫原性等。化学修饰剂之 一的单甲醚聚乙二醇(mPEG-20000)具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙棘铜／锌ＳＯＤ的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步骤：　　（１）将洁净的沙棘枝在０～４℃温度下粉碎后，按１∶５～１∶１５的料液重量体积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；　　（２）将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；　　（３）在所述上清液中加入其体积的０．３～０．４倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；　　（４）在０～４℃温度下，用料液重量体积比为１∶２～１∶５的磷酸缓冲液对所述超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；　　（５）选择ＫＣＮ和Ｈ２Ｏ↓［２］作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂的...

【技术特征摘要】
一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步骤(1)将洁净的沙棘枝在0～4℃温度下粉碎后，按1∶5～1∶15的料液重量体积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；(2)将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其体积的0.3～0.4倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0～4℃温度下，用料液重量体积比为1∶2～1∶5的磷酸缓冲液对所述超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)选择KCN和H2O2作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂的敏感性不同来判断所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品为铜锌超氧化物歧化酶粗制品；(6)将所述铜锌超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE 52层析柱，并用5BV～7BV的Tris HCl缓冲液平衡；其中Tris HCl缓冲液的pH值为7.4～8.6，浓度为25mmol/L～60mmol/L；(7)在所述装有铜锌超氧化物歧化酶粗制品的DEAE 52层析柱上，用溶于的硼酸 硼砂缓冲液的活化好的分子量为20000的单甲醚聚乙二醇来修饰铜锌超氧化物歧化酶；(8)用pH值为7.4～8.6、浓度为15mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：索有瑞，利毛才让，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：63[中国|青海]