【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，特别涉及一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、为应对全球气候变暖和石化资源过度消耗，节能减排已成为全球发展共识。甲烷是仅次于二氧化碳(co2)的第二大温室气体源头，其20年期全球变暖潜力值是co2的86倍，实现甲烷高效增值利用已得到高度关注并成为国内外研究热点。作为天然气和页岩气的主要成分，甲烷储量丰富、可再生、价格低廉、微生物可利用等优势，也促使其成为极具应用潜力的下一代工业生物碳源。
2、嗜甲烷菌是一种能够以甲烷(或甲醇)为唯一碳源和能源进行生长和代谢的微生物，在缓解甲烷排放方面发挥着重要作用。由于抗污染能力强、生长快速且能够在温和生长条件下实现甲烷利用，嗜甲烷菌被认为是理想的甲烷生物催化剂改造宿主。由于嗜甲烷菌的工程改造研究正处于发展期，一系列技术瓶颈亟需解决，其中，低碳转化效率和低代谢活性仍是限制嗜甲烷菌广泛应用于甲烷转化研究的关键因素。
3、通过应用先进的生物技术开发的嗜甲烷菌人工细胞已实现多种甲烷基高价值化学品的合成。在嗜甲烷菌工程菌株设计与构建过程中，人们倾向于将大肠杆菌中已明确的合成途径用于甲烷利用途径的构建。现阶段研究人员已成功构建出多种嗜甲烷工程菌，然而这些菌株只能将甲烷转化为有机酸、异丁醇、生物油脂、细胞蛋白等产品，不能用于产甘油及其衍生物。c3平台化学品，如甘油和1,3-二羟基丙酮(dha)，在合成化学品、燃料和材料方面具有巨大的应用潜力。嗜甲烷菌代谢途径中包含有多种c3中间体，如果能够将这些中间
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌及构建方法和应用，通过基因组整合及质粒表达的方法分别将外源磷酸甘油酯酶外源基因gpp1及甘油脱氢酶外源基因dhad在嗜甲烷菌宿主表达，从而完成底盘细胞甘油及其衍生物dha合成模块的搭建，由此获得转化甲烷制备产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌；在构建目标途径过程中实现胞内辅因子再生平衡，促进甲烷碳定向分配，从而提高碳转化效率，实现c3平台化合物的高效合成，进一步推动一碳气体利用负碳技术开发及应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是：
3、一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，该嗜甲烷菌宿主中引入有异源磷酸甘油酯酶gpp及甘油脱氢酶dhad。
4、所述嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(methylomonas)、甲基杆菌属(methylobacter)、甲基球菌属(methylococcus)、甲基微菌(methylomicrobium)、甲基球形属(methylosphaera)、甲基热菌(methylocaldum)、甲基八叠球菌属(methylosarcina)、甲基弯曲菌属(methylosinus)、甲基孢囊菌属(methylocystis)、甲基细胞菌属(methylocella)和甲基帽菌属(methylocapsa)中的一种。
5、所述的甲基微菌是methylotuvimicrobium buryatense或methylotuvimicrobiumalcaliphilum；
6、methylotuvimicrobium buryatense具体为methylotuvimicrobium buryatense5gb1c；
7、methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20z。
8、所述的磷酸甘油酯酶gpp，来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，其密码子优化后核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
9、所述的甘油脱氢酶dhad来源于肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)，其密码子优化后核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。
10、基于上述一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌的构建方法，通过基因组整合及质粒表达的方法分别将外源磷酸甘油酯酶外源基因gpp1及甘油脱氢酶外源基因dhad在嗜甲烷菌宿主中表达，从而完成底盘细胞甘油及其衍生物dha合成模块的搭建。
11、所述的构建方法具体如下：
12、(1)分别将编码磷酸甘油酯酶gpp的外源基因gpp1、编码甘油脱氢酶的外源基因dhad与ptac启动子串联得到外源ptac-gpp1及ptac-gpp1-dhad基因片段；将外源基因片段ptac-gpp1、ptac-gpp1-dhad通过同源重组策略整合至嗜甲烷菌基因组dhak位点，获得工程菌株mbgpp-1及mbdha-1；
13、(2)通过质粒pawp89过表达内源甘油-3-磷酸脱氢酶g3pdh，将过表达质粒分别转移至工程菌株mbgpp-1及mbdha-1宿主细胞，获得产甘油及其衍生物的嗜甲烷菌工程mbgpp-2及mbdha-2。
14、一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌的应用，所述嗜甲烷菌工程菌能够应用在甲烷生物转化及其减排中，以一碳化合物甲烷为碳源，在嗜甲烷菌中转化甲烷生成甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)。
15、所述碳源甲烷能够用沼气或甲醇替换。
16、利用转化后的甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)为碳源，培养能够合成中长链天然产物工程菌株，实现转化甘油合成多种大宗化学品和精细化学品。
17、本专利技术有益效果体现在：
18、1、本专利技术提供一种产甘油及其衍生物dha的嗜甲烷菌工程菌，通过引入异源磷酸甘油酯酶gpp1及甘油脱氢酶dhad，构建一条可以利用甲烷(沼气或甲醇)为底物生成甘油及其衍生物dha的代谢通路；通过利用异源nad+依赖的功能酶甘油脱氢酶dhad在构建目标途径过程中产生nadh，实现胞内辅因子再生平衡，从而提高甲烷碳转化率。
19、2、利用一碳化合物为碳源，通过转化甲烷产甘油及其衍生物dha，原料可以是甲烷、沼气或甲醇，可来源于固体废弃物的厌氧消化或者二氧化碳催化合成，具有成本低廉，仅通过生物发酵方法工艺操作简单，是工程菌株可以重复使用，有助于甲烷减排的优势；该技术为商业化利用沼气生产甘油及其衍生物dha，以及生物转化固体废弃物高值化学品提供借鉴。
20、3、本专利技术所提供的嗜甲烷菌工程菌，还能利用转化后的甘油为碳源，培养能够合成中长链天然产物工程菌株，实现转化甘油合成多种大宗化学品和精细化学品，实现一碳化合物的高效生物转化利用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，包括嗜甲烷菌宿主，该嗜甲烷菌宿主中引入有异源磷酸甘油酯酶GPP及甘油脱氢酶dhaD。
2.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobium buryatense或Methylot
4.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述的磷酸甘油酯酶GPP，来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其密码子优化后核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述的甘油脱氢酶dhaD来源于肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，其密码子优化后核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌的构建方法，其特征在于，通过基因组整合及质粒表达的方法分别将外源磷酸甘油酯酶外源基因gpp1及甘油脱氢酶外源基因dhaD在嗜甲烷菌宿主中表达，从而完成底盘细胞甘油及其衍生物DHA合成模块的搭建。
7.根据权利要求6任意一项所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述的构建方法具体如下：
8.一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌的应用，其特征在于，所述嗜甲烷菌工程菌能够应用在甲烷生物转化及其减排中，以一碳化合物甲烷为碳源，在嗜甲烷菌中转化甲烷生成甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)。
9.根据权利要求8所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌的应用，其特征在于，所述碳源甲烷能够用沼气或甲醇替换。
10.根据权利要求8所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(DHA)的嗜甲烷菌工程菌的应用，其特征在于，利用转化后的甘油为碳源，培养能够合成中长链天然产物工程菌株，实现转化甘油合成多种大宗化学品和精细化学品。
...【技术特征摘要】
1.一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，包括嗜甲烷菌宿主，该嗜甲烷菌宿主中引入有异源磷酸甘油酯酶gpp及甘油脱氢酶dhad。
2.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(methylomonas)、甲基杆菌属(methylobacter)、甲基球菌属(methylococcus)、甲基微菌(methylomicrobium)、甲基球形属(methylosphaera)、甲基热菌(methylocaldum)、甲基八叠球菌属(methylosarcina)、甲基弯曲菌属(methylosinus)、甲基孢囊菌属(methylocystis)、甲基细胞菌属(methylocella)和甲基帽菌属(methylocapsa)中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述的甲基微菌是methylotuvimicrobium buryatense或methylotuvimicrobium alcaliphilum；
4.根据权利要求1所述的一种产甘油及其衍生物1,3-二羟基丙酮(dha)的嗜甲烷菌工程菌，其特征在于，所述的磷酸甘油酯酶gpp，来源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，其密码子优化后核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
5.根据...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。