【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学品分析，具体是涉及一种胺活性聚乙二醇中非活化杂质检测方法。
技术介绍
1、聚乙二醇(peg)及其衍生物是一种在生物制药工业中具有广泛应用的合成聚合物，与肽、蛋白质、脂质、寡核苷酸和小分子药物形成偶联物。聚乙二醇化的药物在保留其原有的生物活性的同时能够改进其药代动力学特征，改善药物的水溶性、生物相容性、稳定性等性质。其中，pegnhs酯是一种胺活性的聚乙二醇化试剂，其可以通过亲核攻击药物的伯胺基的发生反应，形成酰胺键并释放nhs。目前的胺活性聚乙二醇中可能存在少量杂质，其杂质的结构与活性聚乙二醇的结构相似，难以分离，会对其质量造成影响，为了控制胺活性聚乙二醇的质量，需要一种合适的方法来将胺活性的聚乙二醇与其杂质分开。
2、其中，pegnhs酯属于常见的胺活性的聚乙二醇，其具有很多种构型，其中，y型pegnhs酯具有较大的空间结构，比如，以如下结构为例：
3、
4、与线性pegnhs酯相比，y型pegnhs酯具有多个端基，进而具有多个药物连接点、可以负载多个药物分子，广泛应用于多肽和小分子药物的peg化修饰，另外y型peg-nhs酯具有很强的水溶性，使蛋白质和其他含有赖氨酸的生物制剂能够进行简单有效的修饰，
5、现有技术采用了很多方法，如(analytical methods to qualify and quantifypeg and pegylated biopharmaceuticals)中开发了一种在线的2d lc系统检测游离的聚乙二醇试剂(methyl-pe
6、现有技术(isoform separation and binding site determination ofmono-pegylated lysozyme with ph gradient chromatography)公开了一种应用线性ph梯度色谱法分离5kda和10kda m-peg醛修饰的单聚乙二醇溶菌酶异构体，在阳离子交换柱上用线性ph梯度分离单聚乙二醇化溶菌酶亚型，结果用maldi-ms分析，其方法对仪器要求高，不能套用在色谱方法上。
7、现有技术(towards improved characterisation of complex polyethyleneglycol excipients using supercritical fluid chromatography-evaporative lightscattering detection-mass spectrometry and comparison with size exclusionchromatography-triple detection array)采用超临界流体色谱(sfc)结合蒸发光散射探测器(elsd)和质谱仪(ms)来描述功能化聚乙二醇(peg)2000类似物，m-peg-oh2000、m-peg-cm 2000和cm-peg-cm 2000的类似物(其中cm＝och3、cm＝och2cooh)，披露了sfc对特定peg类似物中的同源序列的选择性增强，对材料质量的更详细的评价，但是，采用sfc-elsd-ms方法仪器结构复杂，可以选择的流动相的数目有限，方法的灵活性不如液相色谱法。
8、现有技术(evaluation of supercritical fluid chromatography for testingof peg adducts in pharmaceuticals)采用超临界流体色谱法(sfc)，利用蒸发光散射检测分离了平均分子量为400～6000da的聚乙二醇混合物，其色谱柱是beh(乙基乙烯桥接杂交)柱(150mm×3mm,1.7m)，流动相是二氧化碳和甲醇的混合物，该方法能够从药物-赋形剂相互作用中分离peg和peg加合物，该方法分析的目标物的结构差异较大，不能确保其能分离结构类似的胺活性聚乙二醇及其杂质。
9、由上述可知，现有技术鲜有兼顾操作简单，结果准确，稳定性高，精密度好的检测方法，能够很好的对胺活性聚乙二醇进行质量控制。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种胺活性聚乙二醇的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的现有技术鲜有能分离并检测出胺活性的聚乙二醇及其结构相近的杂质的检测方法的空白。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术提供一种胺活性聚乙二醇的中非活性杂质的检测方法，取待测样品，并添加十二胺溶液溶解并衍生，待其反应完全后，作为待测液；采用高效液相色谱法进行检测；所述高效液相色谱法采用120a孔径十八硅烷键合硅胶为固定相，以水为流动相a，以甲醇为流动相b进行梯度洗脱，所述高效液相色谱法采用蒸发光散射检测器(elsd)检测，得到非活性杂质含量。
4、所述胺活性聚乙二醇的结构为：
5、所述非活性杂质结构为：
6、a为c或n；
7、r1为连接基团，选自：单键、c1-c6亚烷基；
8、r2、r3独立的选自：c1-c6亚烷基、-o-、-s-、-c(o)-、-c(o)o-、
9、及或其组合组成的组；
10、r4选自：-h、c1-6直链/支链烷基；
11、所述peg的分子量为10～80kda，比如，所述peg的分子量可以为10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、55kda、60kda、65kda、70kda、75kda、80kda。
12、本专利技术中，采用十二胺对样品中活性成分进行衍生，以加大样品与杂质的分离度，使样品与杂质的分离度符合要求。
13、进一步的，所述胺活性聚乙二醇为y-nhs-40k，其结构为：
14、
15、优选的，所述peg的分子量为40kda
16、进一步的，所述非活性杂质为y-cooh-40k，结构为：
17、
18、优选的，所述胺活性聚乙二醇与非活性杂质中的peg分子量相同。
19、进一步的，所述十二胺溶液为十二胺甲醇溶液；
20、优选的，所述十二胺甲醇溶液的中十二胺的浓度为1～5mg/ml，可以为1mg/m、2mg/m、3mg/m、4mg/m或5mg/m，优选为3mg/ml；
21、进一步的，所述固定相的温度为35～40℃；
22、优选的，所述固定相温度包括不限于：35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃，优选为40℃
23、进一步的，所述高效液相色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胺活性聚乙二醇中非活性杂质的检测方法，其特征在于，取待测样品，添加十二胺溶液溶解并衍生，待其反应完全后，作为待测液；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胺活性聚乙二醇为Y-NHS-40K，其结构为：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非活性杂质结构为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十二胺溶液为十二胺甲醇溶液；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相的温度为35～40℃，优选为40℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法流动相的流速为0.8～1.2mL/min，优选流速为1.0mL/min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样量为8～10μL，优选为10μL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法以十八硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱参数为：4.6*250mm，5μm。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，流动相A和流动相B以体积百分数计，洗
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，本方法采用外标对数线性法计算含量,对非活性杂质进行线性验证。
...【技术特征摘要】
1.一种胺活性聚乙二醇中非活性杂质的检测方法，其特征在于，取待测样品，添加十二胺溶液溶解并衍生，待其反应完全后，作为待测液；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胺活性聚乙二醇为y-nhs-40k，其结构为：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非活性杂质结构为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十二胺溶液为十二胺甲醇溶液；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相的温度为35～40℃，优选为40℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺娇，朱丹丹，何平，赵宣，
申请(专利权)人：天津键凯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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