【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物合成，具体涉及一种固定化底物制备茶黄素的方法。
技术介绍
1、茶黄素是儿茶素分子的二聚体产物，是存在于红茶中的一种金黄色色素。成品茶中的茶黄素含量稀少，仅0.5～1.5％，提取成本高昂，被誉为茶叶中的“软黄金”，在医疗健康领域广泛作用。茶黄素的工业化制备，基本都采取内源性或外源性酶促发酵的方法。
2、内源性酶促发酵，指的是采用鲜茶叶内源性的多酚氧化酶ppo和过氧化物酶pod，通过冷冻及控温发酵等相关工艺技术，制备高茶黄素含量的茶叶，再提取精制高含量的茶黄素；外源性酶促发酵，指的是利用富含多酚氧化酶的外源性酶源，酶促催化儿茶素合成制备茶黄素。现有的外源性酶催化技术，分为游离性酶催化和固定化酶催化两种技术路线。
3、其中，固定化酶催化是指将提取的ppo粗酶，经过纯化后，再通过诸如离子结合、生物特异性相互作用、废铁一星相互作用、疏水作用、螯合作用或亲和结合等方式，固定在适当的载体上，然后与反应体系中的含儿茶素类物质的溶液接触，在有氧参与及合适的ph值条件下，酶促催化儿茶素类分子聚合生成茶黄素。这种工艺酶的纯化和固定化成本较高，固定化酶使用次数较低，易产生大量工业废弃物；ppo酶在纯化及固定化过程中，酶与载体的多个活性点接触及键合，导致酶的空间构型固化，酶的空间位形、结构和构象都会较游离态发生改变，在载体上固化后的酶很难在空间构型上发生改变，对底物儿茶素的催化选择性发生变化，尤其对酯型儿茶素的催化能力产生干扰。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种固定化底物制备茶黄素的方法，包括以下步骤：
4、(1)将茶多酚溶液与惰性吸附载体混合进行吸附后依次水洗和醇洗，得到固定化底物；所述惰性吸附载体包括大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂的孔径为10～180埃；所述醇洗用醇液的浓度为4～20wt％；
5、(2)将所述固定化底物与酶液混合且通氧进行酶促反应，得到酶催化载体；所述酶液中的酶为多酚氧化酶ppo；
6、(3)将所述酶催化载体脱附得到的洗脱液浓缩，得到茶黄素。
7、优选的，步骤(1)中，所述茶多酚溶液的浓度为0.5～100g/l。
8、优选的，步骤(1)中，所述茶多酚溶液中的茶多酚与惰性吸附载体的质量比为3～15:100。
9、优选的，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系ph值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。
10、优选的，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂包括lx-8树脂、lx-5树脂、ab-8树脂、nka树脂和nka-9树脂中的一种或几种；
11、所述惰性吸附载体还包括硅胶和氧化铝中的一种或几种。
12、优选的，步骤(2)中，所述固定化底物与酶液的体积比为0.5～1:0.5～1。
13、优选的，步骤(2)中，所述酶促反应的温度为5～35℃，酶促反应体系ph值为4.5～6.5，氧气体积浓度为60～90％，保温时间为4～8小时。
14、优选的，所述酶促反应采用a380测试惰性吸附载体醇提液，监控反应进行；
15、所述测试惰性吸附载体醇提液为：每反应30min取固定化底物和乙醇混合，室温超声振荡提取，吸取上清液；
16、测定所述上清液在380nm的吸光度值，在吸光度值终止上升后停止酶促反应。
17、优选的，步骤(2)中，所述酶液为诺维信的多酚氧化酶或沧州夏盛酶生物技术有限公司的漆酶，或梨匀浆过滤得到的梨汁，或鲜茶叶匀浆过滤得到的粗酶液。
18、优选的，步骤(3)中，所述脱附用洗脱剂为浓度60～80wt％的食用乙醇。
19、本专利技术提供了一种固定化底物制备茶黄素的方法。本专利技术提供的方法以固定化底物的途径进行催化聚合，将天然植物单体儿茶素类分子底物，以非共价键的方式富集在惰性吸附载体上，实现非键合方式固定化，形成多分子聚集态的形式，并加以纯化(水洗和低浓度醇洗)，再加入高选择性的游离外源ppo酶液进行催化，在水溶液中游离性的ppo酶蛋白质链形的分子构架空间位形舒展，对酯型及非酯型的儿茶素类物质催化活性高；同时，因为底物被大部分锁定在吸附载体上，游离在酶液中的底物浓度低，底物对酶的毒化作用及对酶活的抑制作用大大降低，在解析-催化聚合-吸附的微动态平衡条件下，高效率的催化载体上的富集底物儿茶素聚合成二聚体类物质茶黄素，开创性地将底物儿茶素的纯化及酶促氧化缩合集中在同一载体上完成，极大地简化了工艺的操作难度，操作简单。
20、本专利技术开创性地以固定化底物的途径催化合成茶黄素，后续可以将该富集了茶黄素的树脂简单真空干燥后，用该富集了茶黄素的载体为基础模板，进行后续的分子功能团接枝改性，为低浓度的功能性小分子物质的富集、纯化及后续的固定化再靶向催化合成功能性大分子提供了新的思路，开发前景广阔。
21、相比于现有技术，本专利技术提供的方法绿色环保，不产生废弃的固定化酶等有毒有害废弃物，不使用毒性较强且易燃易爆的乙酸乙酯和石油醚，脱除咖啡因及除杂过程中不使用有毒有害的卤代烷烃，可以在同一生产线上生产高含量茶多酚(固定化底物)和高含量茶黄素，并为后续的以茶黄素为底物进行活性基团分子的修饰和分子改性等操作奠定了基础平台。
22、进一步的，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系ph值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。步骤(2)中，所述酶促反应的温度为5～35℃，酶促反应体系ph值为4.5～6.5，氧气体积浓度为60～90％，保温时间为4～8小时。本专利技术提供的方法操作条件温和，有利于安全生产，节约能源，降低生产成本。
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1.一种固定化底物制备茶黄素的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述茶多酚溶液的浓度为0.5～100g/L。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述茶多酚溶液中的茶多酚与惰性吸附载体的质量比为3～15:100。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系pH值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂包括LX-8树脂、LX-5树脂、AB-8树脂、NKA树脂和NKA-9树脂中的一种或几种；
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定化底物与酶液的体积比为0.5～1:0.5～1。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶促反应的温度为5～35℃，酶促反应体系pH值为4.5～6.5，氧气体积浓度为60～90％，保温时间为4～8小时。
8.根据权利
9.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶液为诺维信的多酚氧化酶或沧州夏盛酶生物技术有限公司的漆酶，或梨匀浆过滤得到的梨汁，或鲜茶叶匀浆过滤得到的粗酶液。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脱附用洗脱剂为浓度60～80wt％的食用乙醇。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化底物制备茶黄素的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述茶多酚溶液的浓度为0.5～100g/l。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述茶多酚溶液中的茶多酚与惰性吸附载体的质量比为3～15:100。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系ph值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂包括lx-8树脂、lx-5树脂、ab-8树脂、nka树脂和nka-9树脂中的一种或几种；
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫国，周溢丹，朱博，周广勇，赵印天，管华杨，
申请(专利权)人：南通德诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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