【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因诊断，尤其涉及核酸片段及其作为标志物在制备回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂中的应用。
技术介绍
1、回旋状视网膜脉络膜萎缩(gyrate atrophy of the choroid and retina,ga)是一种罕见的、由于oat基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病。其主要的眼部症状和体征包括夜盲、高度近视、早期白内障形成以及脉络膜视网膜环形萎缩、黄斑病变等，萎缩性病变具有扇形或花环状边界。此病还可累及全身其他组织器官，主要有脑部、周围神经系统、骨骼肌和毛发异常等。该病通常儿童期发病，40-60岁失明。可给予维生素b6、赖氨酸、低蛋白、低精氨酸饮食进行治疗，但治疗效果尚难肯定，且脉络膜视网膜萎缩是不可逆的。
2、ga为单基因遗传病，具有显著的临床和遗传异质性，即使是同一家系中携带相同致病突变的患者也可出现不同的临床特征。由于其眼外表现在多数情况下是亚临床的，导致其易被误诊、漏诊，基因检测使得早期、快速的精准诊断成为可能。
3、流行病学研究显示，ga的全球发病率约为1/1500000，芬兰地区发病率较高，约为1/50000，我国尚无患病率的报道。目前有关ga的报道大多来自西方国家，我国报道的非常少，考虑到种族的差异性，对我国ga患者进行深入的遗传学研究，探寻潜在的oat相关的致病突变显得尤为重要。
4、oat基因位于常染色体10q26.13,由10个外显子组成，其中1号外显子不编码，基因组dna跨度为21kb。其编码一种依赖磷酸吡哆醛的线粒体基质酶-oat，其在肝脏、肾脏、
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供核酸片段及其作为标志物在制备回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂中的应用。
2、本专利技术在研究过程中利用高通量测序技术，在基因水平上对一个中国家系进行突变分析，鉴定出了一个oat基因新突变位点，其在ga患者oat基因上呈纯合突变。并分别通过生物信息学和实验手段，验证了该突变造成启动子右侧缺失95bp且exon1跳跃，造成异常剪接，由此证实此变异为有害致病变异。为ga的诊断和治疗研究提供指导。并且通过分析ga患者的超广角眼底照、视力、眼轴、眼底自发荧光(faf)、眼底荧光素血管造影(ffa)和扫频光学相干断层扫描(ss-oct)、全视野视网膜电图(erg)和鸟氨酸浓度等特征，描述了oat新突变的相关临床特征，也证实了此突变位点与ga的相关性。
3、基于此，本专利技术提供了如下方案：
4、第一方面，本专利技术提供了一种核酸片段，其具有如seq id no:1所示的核酸序列。具体如下：
5、
6、本专利技术研究表明，该核酸片段纯合突变可以导致ga疾病。通过检测片段是否缺失，可以有效地确定生物样品是否为患有ga疾病的生物样品。
7、第二方面，本专利技术提供了一种基因突变体，其为在oat基因中缺失seq id no:1所示的核酸片段。
8、本专利技术所基于的野生型oat基因在ensembl数据库中的基因编号为：enst00000368845.6。以上核苷酸突变对应的物理位置为：c.-31_-30+22del,chr10:126107419-126107443的位置丢失24个碱基(aggtaccgtctgggcgccgctgtc)其后的序列均发生改变。本专利技术提供的基因突变体与与野生型oat基因相比，选自下列突变：c.-31_-30+22delaggtaccgtctgggcgccgctgtc突变，此突变位于5′端非编码区(untranslationregion,utr)。
9、第三方面，本专利技术提供了如前所述的核酸片段和/或如前所述的基因突变体在如下任一项中的应用：
10、i)、作为标志物制备回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂；
11、ii)、作为靶点构建回旋状视网膜脉络膜萎缩模型；
12、iii)、作为标志物筛选回旋状视网膜脉络膜萎缩模型；
13、iv)、作为靶点制备防治回旋状视网膜脉络膜萎缩的药物。
14、第四方面，本专利技术提供了回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂，包括所述核酸片段的检测试剂和/或所述的基因突变体的检测试剂。
15、本专利技术中，所述检测试剂为pcr检测试剂，其包括靶向所述核酸片段或所述基因突变体的引物和/或探针。本专利技术对检测引物和/或探针的核酸序列不做限定。作为一个可行方案，所述pcr检测试剂包括2个引物对，
16、引物对1中，上游引物如seq idno:2所示，下游引物如seq id no:3所示；
17、引物对2中，上游引物如seq idno:4所示，下游引物如seq id no:5所示。
18、第五方面，本专利技术提供了回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断方法，其包括以如前所述的诊断试剂对样本进行检测。本专利技术中，所述样本为血液、血浆、血清和/或眼部组织。本专利技术所述的诊断方法还包括，对检测获得的数据进行分析，根据是否缺失seq id no:1所示的核酸片段，判断受试者的健康状况。具体的，seq id no:1所示的核酸片段缺失，则受试者为回旋状视网膜脉络膜萎缩疾病的携带者和/或患者。
19、第六方面，本专利技术还提供了构建回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的试剂，其包括敲除seq id no:1所示核酸片段的试剂。
20、本专利技术中，敲除敲除seq id no:1所示核酸片段的试剂包括，基于crispr-cas9、锌指核酸酶和/或crispr-cpf1方法的敲除质粒。一些实施例中，所述敲除质粒包括骨架载体和promoter(151bp)-exon1(51bp)-部分intron1(709bp),具体序列为：
21、promoter(151bp):
22、aaagatccttgatgcgcggccggagggcggggcggaggacgggacccacgcgattggtatcctgccctccgccccagccaatgagcggcgagggtgtcttgggggcggggcagaatcagcctttaagttgcagtgactctccggcgtcact
23、exon1(51bp):
24、gttgcgcttcatagacgccgcgtgtacccggttgtcctcaggcgctgtcag
25、部分intron1(709bp)
26、gtaccgtctgggcgccgctgtcctggggctctggttcgggccctggccggggttccctgacagcggcgggggaggcgggcgggcgcggggtggccgcggcccgg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.核酸片段，其具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
2.基因突变体，其为在OAT基因中缺失权利要求1所述的核酸片段。
3.权利要求1所述的核酸片段和/或权利要求2所述的基因突变体在如下任一项中的应用：
4.回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂，其包括权利要求1所述核酸片段的检测试剂和/或权利要求2所述的基因突变体的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂，其特征在于，所述检测试剂为PCR检测试剂，所述PCR检测试剂包括2个引物对，
6.构建回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的试剂，其特征在于，包括敲除权利要求1所述的核酸片段的试剂。
7.回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的构建方法，其特征在于，包括以权利要求6中所述的试剂敲除细胞中OAT基因的SEQ ID NO:1所示片段。
8.回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的筛选试剂，其特征在于，包括权利要求1所述核酸片段的检测试剂和/或权利要求2所述的基因突变体的检测试剂。
9.回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的筛选方法，其特征在于，包括以权利要求8所述的筛选试
10.治疗回旋状视网膜脉络膜萎缩的药物，其特征在于，包括使权利要求1所述的核酸片段插入权利要求2所述基因突变体中的试剂。
...【技术特征摘要】
1.核酸片段，其具有如seq id no:1所示的核酸序列。
2.基因突变体，其为在oat基因中缺失权利要求1所述的核酸片段。
3.权利要求1所述的核酸片段和/或权利要求2所述的基因突变体在如下任一项中的应用：
4.回旋状视网膜脉络膜萎缩的诊断试剂，其包括权利要求1所述核酸片段的检测试剂和/或权利要求2所述的基因突变体的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂，其特征在于，所述检测试剂为pcr检测试剂，所述pcr检测试剂包括2个引物对，
6.构建回旋状视网膜脉络膜萎缩模型的试剂，其特征在于，包括敲除权利要求1所述的核酸片段的试剂。
7.回...
【专利技术属性】
技术研发人员：高凤娟，段聪，宗媛，徐格致，胡竹林，张婷，居钰乔，张利伟，李娟娟，马璇，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：
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