【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶固定化，具体涉及一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶。
技术介绍
1、酶在正常条件下会表现出很高的选择性和反应性，但对ph和温度较敏感而易失活，游离酶价格昂贵使用一次后不能回收利用，增加了使用成本。
2、酶的固定化在很大程度上能够解决此类问题，固定化纤维素酶具有反应时间短、保存期较长、灵敏度高、反应快捷等优点。酶固定化方法有物理法和化学法两大类，其中物理法包括吸附法和包埋法，化学法包括共价结合法和交联法等。由于传统方法所制备的固定化纤维素酶的酶活保留率较低，固定化纤维素酶在使用一定时间及次数后，酶活力明显下降，大大降低了酶的应用性能。因此有必要寻求一种合适的载体，来固定纤维素酶，使固定化纤维素酶具有更高的的重复使用性，更高的稳定性，从而达到降低使用成本的目的。
3、介孔二氧化硅具有可调的孔径尺寸和结构、比表面积高、孔隙率高、热稳定性和机械稳定性高、本身无毒等特点，可在粒子表面进行选择性功能化。其中，树枝状介孔二氧化硅纳米材料具有树枝状空腔结构，因而具有更高的孔渗透性、更大的孔体积、更好的粒子内表面的可接触性。因而成为一种优良的酶固定化载体。树枝状介孔二氧化硅纳米材料是一种特殊形貌的酶固定化载体，比传统的介孔二氧化硅材料增加了优势：(1)它的整体形貌为树枝状，开放性好，内有树枝状空腔，存在10～25nm的内部外部堆积孔；(2)可调控性强，由于表面含有裸露的硅羟基，能够和功能化硅烷缩合，形成带有功能基团(巯基、氨基、羧基)的表面，且可调控其形貌，包括纳米粒子大小、孔径大小等；(
4、树枝状介孔二氧化硅具有较大的孔道、较高的比表面积和良好的生物相容性，因此具有较大的蛋白负载潜力。然而，使用这些纳米颗粒固定化酶的应用很少有报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶。本专利技术首先利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对树枝状介孔二氧化硅纳米材料进行修饰氨基，合成氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料；再利用此材料作为载体来固定纤维素酶，得到以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶；载体上的氨基与纤维素酶分子上的羧基结合，克服现有的酶固定化技术酶活保留率低，重复使用性低的问题。
2、为了实现上述目的，制备出具有稳定性高、重复利用率高的固定化纤维素酶，本专利技术提供以下技术方案：
3、一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，是以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米为载体，吸附纤维素酶制得固定化纤维素酶，载体上的氨基与纤维素酶上的羧基结合，酶分子不易脱落，增加了固定化酶的重复使用次数，而且具有传输阻力小、制备效率高、分离效果好等的优点，其是由如下步骤制备得到：
4、(1)树枝状介孔二氧化硅纳米材料(dmsns)的制备：将0.68g三乙胺溶于15～30ml超纯水，75～85℃下水浴25～35min；然后加入0.38g十六烷基三甲基溴化铵和0.16g水杨酸钠，75～85℃下水浴25～35min；再加入4ml体积分数98％的正硅酸乙酯，75～85℃下水浴1.5～2.5h；降至室温后离心，沉淀用超纯水和乙醇洗涤后干燥，经萃取去除十六烷基三甲基溴化铵模板剂，得到树枝状介孔二氧化硅纳米材料，记为dmsns；
5、萃取是取0.30g超纯水和乙醇洗涤后干燥产物加入到50～70ml无水乙醇和0.5～1.0ml浓盐酸(质量分数36％)中，放置于70～90℃水浴磁力搅拌器加热5～8h，6000～10000rpm离心2～5min，所得沉淀用乙醇清洗2～5次，再于70～90℃下干燥，研磨后得到树枝状介孔二氧化硅纳米材料(dmsns)；
6、(2)氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体(admsns)的制备：将0.3～0.5g步骤(1)制备的dmsns加到60～100ml甲苯中，加热至澄清后再加入0.3～0.5ml的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，dmsns与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的用量比例为1g:1ml，加热回流3～5h；降至室温后离心，沉淀用甲苯清洗，干燥后研磨得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体，记为admsns；
7、(3)固定纤维素酶：不同浓度纤维素酶溶液(0.1～0.6mg/ml)配制方法：准确称取纤维素酶0.05g，用50mm的ph＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至50ml，得到浓度为1mg/ml的纤维素酶溶液；再用50mm的ph＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液将浓度为1mg/ml的纤维素酶溶液稀释成不同浓度(0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml)；
8、取10mg步骤(2)得到的admsns，加入到10ml浓度为0.1～0.6mg/ml的纤维素酶溶液中；然后在转速为150～200r/min、4℃的水浴磁力搅拌器上搅拌4～12h，6000～10000rpm离心2～5min后所得沉淀用50mm的ph 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液洗涤2～4次，冻干后得到以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，记为cellulase@admsns；
9、50mm的ph＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液的配制，是首先称取4.10g无水乙酸钠，用超纯水溶解并定容至1000ml，得到50mm的乙酸钠溶液；再量取2.86ml冰乙酸，用超纯水定容至1000ml，得到50mm的乙酸溶液；然后量取乙酸钠溶液，用乙酸溶液调节ph，即得到50mm的ph＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。
10、本专利技术的特点在于：
11、(1)admsns合成过程中，利用三乙胺调控介孔二氧化硅纳米材料的结构，得到孔径均一、尺寸为190～210nm、孔隙为10～25nm的树枝状介孔二氧化硅纳米材料，该材料具有树枝状皱襞孔隙，其大小与纤维素酶分子大小相似，载体上面的氨基与酶分子上的羧基结合，不会影响酶分子的活性位点，可以避免酶的失活，使固定化酶保持较高的酶活保留率，并且能够增加固定化酶的重复使用次数。
12、(2)与游离纤维素酶相比，本专利技术得到的cellulase@admsns的酶活性仍能保持85％以上。游离纤维素酶的最适温度为30℃，cellulase@admsns的相对酶活性剩余60％，而纤维素酶仅剩40％，cellulase@admsns的ph稳定性范围变得更广泛，在ph＝4～7间比较稳定。
13、本专利技术具备的有益效果
14、1.本专利技术制备出admsns，该材料具有开放性好、可调控性强、稳定性高、比表面积高的显著特点，以此为载体，制备出cellulase@admsns，具有高稳定性、高重复性、高催化活性、检测时间短的特点；其原因是admsns具有如下特点：(1)它的整体形貌为树枝状，分散性好，内有10～25nm树枝状空腔，此空腔与纤维素酶，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，其是由如下步骤制备得到：
2.如权利要求1所述的一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，其特征在于：是称取纤维素酶0.05g，用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至50mL，得到浓度为1.0mg/mL的纤维素酶溶液；再用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液将浓度为1.0mg/mL的纤维素酶溶液稀释，得到浓度为0.1～0.6mg/mL的纤维素酶溶液。
3.如权利要求2所述的一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，其特征在于：50mM的pH＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液的配制，是首先称取4.10g无水乙酸钠，用超纯水溶解并定容至1000mL，得到50mM的乙酸钠溶液；再量取2.86mL冰乙酸，用超纯水定容至1000mL，得到50mM的乙酸溶液；然后量取乙酸钠溶液，用乙酸溶液调节pH，即得到50mM的pH＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。
【技术特征摘要】
1.一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，其是由如下步骤制备得到：
2.如权利要求1所述的一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化纤维素酶，其特征在于：是称取纤维素酶0.05g，用50mm的ph＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至50ml，得到浓度为1.0mg/ml的纤维素酶溶液；再用50mm的ph＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液将浓度为1.0mg/ml的纤维素酶溶液稀释，得到浓度为0.1～0.6mg/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王春艳，金梦迪，张宇航，王怡倩，于笑蕊，王雪娜，唐琨，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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