微孔草△－６脂肪酸脱氢酶基因（Ｍｓ－△６－ＦＡＤ）及用途制造技术

本发明专利技术公开微孔草Δ－６脂肪酸脱氢酶（Ｍｓ－Δ６－ＦＡＤ）基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。微孔草Δ－６脂肪酸脱氢酶（Ｍｓ－Δ６－ＦＡＤ）基因的制备是用微孔草基因的ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，再根据其它植物的（Ｍｓ－Δ６－ＦＡＤ）基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到微孔草Δ－６脂肪酸脱氢酶（Ｍｓ－Δ６－ＦＡＤ）基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明专利技术的微孔草Δ－６脂肪酸脱氢酶（Ｍｓ－Δ６－ＦＡＤ）基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本 专利技术涉及微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(MS-A6-FAD)基因及其制备与用途。
技术介绍
γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是一种多功能油脂成分。许多研究表明GLA 具有多种重要的生理活性作用，它在机体的物质代谢和生理调控上发挥着十分重要的作 用降血脂、抗血栓性心脑血管、预防和治疗高血压、动脉粥样硬化、增强人体的免疫功能，G L A还具有抗革兰氏阴性菌和阳性菌、抗HIV感染、抗肿瘤、抗多种炎症、抗脂质过氧化、抑 制溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用，参见董杰明等“ Y-亚麻酸的保健作用”《卫生 研究》2003，32 (3) :299-301。Δ 6-脂肪酸脱氢酶(Δ 6-FAD)基因是介导GLA合成的关键酶 基因。
技术实现思路
本专利技术提供一种取自我国特有物种-微孔草的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，以及这种 基因的制备方法及用途。微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)系紫草科微孔草属，为二年生草本植物， 主要分布于陕西西南部、甘肃、青海、四川西部、云南西北部、西藏藏东和南部，参见中国科 学院中国植物志编辑委员会《中国植物志》北京科学出版社，1990 151-175。本专利技术所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法是首先提取微孔草的 RNA，再反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核 苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、Ρ2 ；以得 到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草△ _6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根 据测序得到的Ms- Δ 6-FAD基因核心片段序列分别设计微孔草△ _6脂肪酸脱氢酶基因特异 引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5’ P和5’ NP配 对，以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同 样根据测序得到的微孔草△ _6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪 酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自 带的3’ P和3’ NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端 核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设 计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长 翻译区核苷酸序列。在P7、P8引物的5’端分别加入Nco I和Bste II酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济 技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3，P2 :5， -ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3，P3 :5， -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3，P4 5，-TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3，5 ’ P 为5 ’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，5， NP 为5， -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，；P5 :5， -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3，P6 :5’ -AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3，3 ’ P 为5 ’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，3 ’ NP 为5 ’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’P7 :5’ -CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3’P8 :5’ -GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’其中R= A or G ;Y = C or T ;S = C or G。本专利技术所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(MS-A6-FAD)可在油料作物的转 基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作 物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。微孔草富含Y-亚麻酸(表1)，参见高有为，樊铁“微孔草-一种待开发的富含 Y-亚麻酸的新油源”。《中国粮油学报》199813(2) :22-24。表1微孔草和其它植物油的Y -亚麻酸的含量比较本文档来自技高网...

【技术保护点】
微孔草Δ－６脂肪酸脱氢酶基因，其特征是ＳＥＱ　Ｎｏ：１。

【技术特征摘要】
微孔草Δ 6脂肪酸脱氢酶基因，其特征是SEQ No1。2.权利要求1所述的微孔草△_6脂肪酸脱氢酶基因制备方法，其特征是将提取的微 孔草RNA反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的 核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、Ρ2 ；以 得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草△ _6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列； 根据测序得到的HPT基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物 5’端外侧引物Ρ3和巢式引物Ρ4，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5’ P和5’ NP配对， 以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根 据测序得到的微孔草△ _6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草△ _6脂肪酸脱 氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的 3’ P和3’ NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷 酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设计与 该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译 区核苷酸序列。3.权利要求2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法中所用的相关引物，其特 征是上游引物Pl为Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽静，傅华，吴淑娟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]