【技术实现步骤摘要】
本申请涉及病毒标记，尤其涉及一种准确标记特定分子类型神经元的方法及动物模型。
技术介绍
1、crispr-cas系统最初发现于细菌的免疫防御系统，其中crispr是成簇规律的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)与crispr相关蛋白cas9共同组成一套基因编辑系统。该系统包含一个单一的多功能cas9蛋白和向导rna(guide rna，grna)，grna的5’端具有20个核苷酸序列，这些核苷酸序列是与dna特异性结合的互补区，能将cas9引导至特定基因组靶位点；3’端模拟crrna-tracrrna复合物的发夹结构域，能与cas9结合。当表达cas9蛋白和靶向特定基因组位点sgrna的病毒共同存在时，cas9蛋白与sgrna结合并形成核糖核蛋白复合体，可以识别基因组靶序列下游相对保守的“前间隔邻近序列(protospacer adjacent motif，pam)”，进而切割形成dna双链断裂，没有pam序列时，基因组不会被切割，不会形成双链断裂(double-strand breaks,dsb)。因此根据上述crispr-cas9系统的作用原理，可以选取感兴趣的目标基因，并找到目标基因的基因组序列中存在的pam序列，根据pam上游的20个碱基序列，设计出与其互补的grna的n20序列，进而获得靶向目标基因的grna序列，再结合cas9蛋白实现对基因组以及外源dna的特异性切割，切割后的dna通过非同源末端连接或者同源重组的方式
2、目前crispr-cas9技术可应用于大小鼠模型的构建，与传统的转基因技术以及基因靶向技术相比，改善了动物模型成本高、耗时长、成功率低等问题，可以为临床的基因治疗以及神经科学等领域提供了相关动物模型以及技术支持。虽然crispr-cas9技术突破了目前一些小鼠遗传品系的限制，但是在神经科学领域对大脑的研究中，由于大脑包含上千亿个神经元，数量庞大，种类繁多，想要解析大脑复杂的结构与功能，需要对神经元进行分类研究，而对神经元进行精确标记是神经元分类研究的重要前提。但是如果每研究一种类型的神经元就构建一种转基因小鼠，那目前所存在的转基因小鼠品系远远不够。常用的神经元标记方法可以大致分为3类：(1)使用生物化学分子进行标记；(2)利用遗传学方法进行标记；(3)以病毒载体为基础进行标记，这些方法通常结合使用，已经允许选择性地进入少数细胞类型，但仍远未覆盖大多数分子上不同的细胞群体，并且具有耗时费力等局限性，同时部分方法还可能存在脱靶现象，因此亟待需要一种技术能够准确标记特定分子类型神经元的方法，为解析复杂脑结构以及生理功能提供技术支持。
技术实现思路
1、本申请提供了一种准确标记特定分子类型神经元的方法及动物模型，以解决现有技术中神经元标记方法未覆盖大多数分子特征且耗时费力以及存在脱靶的可能性的技术问题。
2、第一方面，本申请提供了一种准确标记特定分子类型神经元的方法，所述方法包括：
3、构建含cas9蛋白序列的高保真cas9质粒；
4、设计特定分子类型神经元中靶向基因组位点的sgrna序列，后与供体片段进行质粒构建，得到供体质粒；
5、构建含报告基因的表达载体；
6、采用病毒分别包装所述cas9质粒、所述供体质粒和所述表达载体，后进行混合，得到病毒液；
7、采用所述病毒液向待测脑区进行病毒注射，以实现对特定分子类型神经元的精确标记；
8、其中，所述供体质粒能被cas9蛋白切割；
9、所述供体片段具有驱动所述报告基因表达的作用。
10、可选的，所述构建含cas9蛋白序列的高保真cas9质粒，包括步骤：
11、构建含cas9蛋白n端的第一cas9质粒；
12、构建含cas9蛋白c端的第二cas9质粒；
13、混合所述第一cas9质粒和第二cas9质粒，并进行包装，得到野生型cas9蛋白质粒；
14、根据所述野生型cas9蛋白质粒，构建突变型第二cas9质粒；
15、分别保存所述第一cas9质粒和所述突变型第二cas9质粒，得到含cas9蛋白序列的高保真cas9质粒。
16、可选的，所述突变型第二cas9质粒包括含hificas9c蛋白的第二cas9质粒和/或含super fi-cas9蛋白的第二cas9质粒。
17、可选的，所述供体片段与所述靶向基因组位点的两端序列相同。
18、可选的，所述病毒包括腺相关病毒。
19、可选的，所述靶向基因组位点包括camkiiα、gad1或chodl基因组位点。
20、可选的，所述供体片段包括tta供体片段或dre供体片段。
21、可选的，所述表达载体包括荧光蛋白序列，所述荧光蛋白序列由所述靶向基因组位点的启动子驱动表达。
22、可选的，所述荧光蛋白序列包括绿色荧光蛋白序列。
23、第二方面，本申请提供了一种动物模型，所述动物模型为经过第一方面所述的方法标记的特定分子类型神经元动物模型。
24、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
25、本申请实施例提供的一种准确标记特定分子类型神经元的方法，基于高保真cas9质粒的crisir/cas9基因编辑技术，配合供体质粒和含报告基因的表达载体所组成的二元系统，并对高保真cas9质粒、供体质粒和含报告基因的表达载体采用病毒进行包装，可以利用病毒携带的高保真cas9质粒在靶向基因组位点的sgrna靶向作用下，定点切割基因组特定位点序列，也同时切割两侧带有grna靶向位点的供体片段，而供体片段可以作为高保真cas9质粒的驱动元件，而该高保真cas9质粒表达后可以驱动报告基因的表达，而被切割后的供体片段插入到基因组靶向位点处，通过dna修复可以将供体片段定向整合到基因组中，而在上述整合过程中，若是正确整合，由于插入片段带有2a自裂肽，可以与内源基因连接在一起，因此会受同一个启动子调控，也即由靶向基因组位点中靶向基因的启动子驱动供体片段的表达，同时在待测脑区的细胞中，供体片段会进一步驱动报告基因的表达；基于上述原理，可以将高保真cas9质粒、供体质粒和含报告基因的表达载体混合注射到相应的脑区，实现对特定类型神经元的精确标记。
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1.一种准确标记特定分子类型神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建含Cas9蛋白序列的高保真Cas9质粒，包括步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变型第二Cas9质粒包括含HiFiCas9C蛋白的第二Cas9质粒和/或含Super Fi-Cas9C蛋白的第二Cas9质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体片段与所述靶向基因组位点的两端序列相同。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包括腺相关病毒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向基因组位点包括CaMKIIα、Gad1或Chodl基因组位点。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体片段包括tTA供体片段或Dre供体片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括荧光蛋白序列，所述荧光蛋白序列由所述靶向基因组位点的启动子驱动表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白序
10.一种动物模型，其特征在于，所述动物模型为经过权利要求1-9任一项所述的方法标记的特定分子类型神经元动物模型。
...【技术特征摘要】
1.一种准确标记特定分子类型神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建含cas9蛋白序列的高保真cas9质粒，包括步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变型第二cas9质粒包括含hificas9c蛋白的第二cas9质粒和/或含super fi-cas9c蛋白的第二cas9质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体片段与所述靶向基因组位点的两端序列相同。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包括腺相关病毒。
6.根...
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