【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用。
技术介绍
1、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是由曲霉属(aspergillus spp.)和青霉属(penicillium spp.)产毒菌株产生的次级代谢产物，主要存在于谷物及其副产品中。ota具有多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害，被列为2b类致癌物。肾脏是对ota最敏感的器官，肾毒性是最典型和最早发现的症状，还被发现有肝毒性、基因毒性、神经毒性、致畸性和免疫抑制。ota会污染两类食品：谷物、香料、咖啡和ph值中性和含水量低的类似物品；以及含水量高、ph值低的水果及其加工产品。大多数物理化学方法对于降解ota是不切实际的，因为它们在食品工业中的应用由于毒素降解不完全而受到限制，或者它们还导致二次污染。相比之下，生物方法不会降低食物的营养价值，并且对解毒ota表现出很高的功效和特异性。
2、ota的脱毒方法主要有三种，物理脱毒、化学脱毒和生物脱毒，其中物理脱毒和化学脱毒方法大部分脱毒效率低，不能广泛适用并且可能导致营养物质的损失和二次污染的问题。生物降解法则是利用微生物或生物酶通过生物代谢将真菌毒素转换成其他低毒或者无毒的化学物质，彻底破坏真菌毒素的化学结构，能实现安全、高效的脱毒目的。近几年筛选出的降解菌，一些菌株是生物吸附作用，这个过程一般是可逆的，真菌毒素可被再次释放出来。此外，影响微生物细胞壁对毒素吸附效果的因素有很多，鉴于以上两点原因，生物吸附法并不是生物脱毒的最佳方法。生物降解作用的菌株又存在孵育时间太长、降
3、总而言之，为解决农产品、饲料原料及饲料中ota污染问题，急需从自然资源中分离筛选安全、高效降解ota且抑制产生ota青霉菌的菌株，并进一步研究其生物特性及降解产物毒性，研发适用于饲料行业的微生物菌制剂，减少养殖业的经济损失。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用，从种植玉米的土壤中分离出一株对赭曲霉毒素a具有较高的降解能力的菌株微杆菌(microbacterium sp.)asag1016，可以克服现阶段可降解ota的微生物不适合实际生产且孵育时间长、降解率较低的缺点，提高对ota降解率，还具有对呕吐毒素与t-2毒素降解的作用，和在抑制青霉菌生长中的应用。
2、具体技术方案如下：
3、微杆菌菌株，命名为微杆菌(microbacterium sp.)asag1016，保藏编号为cgmccno.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
4、ota为赭曲霉毒素a；don为呕吐毒素；t-2为t-2毒素。
5、根据takara细菌基因组dna提取试剂盒步骤和pcr方法提取并扩增该菌株的基因组dna，通过测定16s rrna基因序列的全长约为1500bp，测序后在ncbi使用blast比对，从genbank数据库中对相关序列进行系统发育分析，结合生理生化特征，鉴定为微杆菌。
6、进一步地，所述微杆菌菌株菌落圆形，黄色，有光泽，边缘完整，无芽孢，为革兰氏阳性菌，16s rrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、本专利技术还提供了微杆菌菌株在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、t-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。
8、本专利技术还提供了一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂，所述菌剂的活性成分包括如上述所述的微杆菌菌株(microbacterium sp.)asag1016；或所述微杆菌菌株的液体发酵上清液，或所述微杆菌菌株液体发酵上清液中的胞外酶。
9、取微杆菌asag1016的发酵液、菌体细胞、上清液、上清液+蛋白酶k、胞体、胞体高温处理、上清高温处理运用于降解ota；结果表明：发酵上清液对ota的降解率显著高于其它组别，证明微杆菌asag1016降解ota活性组分存在于发酵上清液中。
10、进一步地，所述菌剂中微杆菌菌株的浓度为od600值为1.0～1.2。
11、本专利技术还提供了一种降解饲料中的赭曲霉毒素的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
12、(1)取上述所述的微杆菌菌株(microbacterium sp.)asag1016，在固体培养基上活化培养；
13、(2)将步骤(1)中活化培养后的菌株接种于液体培养基中，进行种子培养，得到种子液；
14、(3)将培养后的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，将培养完成的菌液制成液态菌剂或/和固态菌剂。
15、进一步地，步骤(1)～(3)中，所述微杆菌菌株的培养最适温度为30～45℃，最适ph值为6.5～8.5。
16、进一步地，步骤(1)中，所述固体培养基为lb固体培养基，所述活化培养的条件为：ph值为7.2～7.6；步骤(2)中，所述液体培养基为lb液体培养基；所述种子培养的条件为：ph值为7.2～7.6；种子培养至od600值为0.7～0.8，达到对数生长期，得到种子液；步骤(3)中，发酵培养至od600值为1.0～1.2。
17、固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；液体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。
18、本专利技术还提供了上述所述的菌剂，或上述所述的制备方法制得的菌剂，在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、t-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。
19、微杆菌asag1016对ota降解步骤为：
20、将菌剂中微杆菌asag1016的初始浓度控制为108cfu/ml，将250μl菌剂加入250μl浓度为100ng/ml的赭曲霉毒素标准品溶液中，调节反应体系的ph值为7.2～7.6，培养温度为37～45℃，反应时间为2h，反应结束后赭曲霉毒素降解率为100％。
21、本专利技术还提供了上述所述的菌剂，或上述所述的制备方法制得的菌剂，在抑制青霉菌生长中的应用。
22、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
23、(1)本专利技术提供的微杆菌asag1016，从种植玉米的土壤中分离得到，可以克服现阶段可降解ota的微生物不适合实际生产且降解率较低的缺点，提高对ota降解率，还具有对呕吐毒素与t-2毒素降解的作用和在抑制青霉菌生长中的应用。
24、(2)本专利技术提供的微杆菌asag1016，能高效快速的降解ota。当ota初始浓度为100ng/ml时，2h后微杆菌对其降解率达100％。
25、(3)经研究可确定微杆菌asag1016可通过生物酶降解作用使得ota降解为无毒的代谢产物。降解过程无毒副作用，无耐本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.微杆菌菌株，其特征在于，命名为微杆菌(Microbacterium sp.)ASAG1016，保藏编号为CGMCC No.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的微杆菌菌株，其特征在于，所述微杆菌菌株菌落圆形，黄色，有光泽，边缘完整，无芽孢，为革兰氏阳性菌；16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的微杆菌菌株在降解饲料中赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。
4.一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括如权利要求1所述的微杆菌菌株，或所述微杆菌菌株的液体发酵上清液，或所述微杆菌菌株液体发酵上清液中的胞外酶。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中微杆菌菌株的浓度为OD600值为1.0～1.2。
6.一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体培养基为LB固体培养基，所述活化培养的条件为：pH值为7.2～7.6；步骤(2)中，所述液体培养基为LB液体培养基；所述种子培养的条件为：pH值为7.2～7.6；种子培养至OD600值为0.7～0.8，达到对数生长期，得到种子液；步骤(3)中，发酵培养至OD600值为1.0～1.2。
9.如权利要求4～5任一项所述的菌剂，或如权利要求6所述的制备方法制得的菌剂，在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。
10.如权利要求4～5任一项所述的菌剂，或如权利要求6所述的制备方法制得的菌剂，在抑制青霉菌生长中的应用。
...【技术特征摘要】
1.微杆菌菌株，其特征在于，命名为微杆菌(microbacterium sp.)asag1016，保藏编号为cgmcc no.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的微杆菌菌株，其特征在于，所述微杆菌菌株菌落圆形，黄色，有光泽，边缘完整，无芽孢，为革兰氏阳性菌；16s rrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的微杆菌菌株在降解饲料中赭曲霉毒素、呕吐毒素、t-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。
4.一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括如权利要求1所述的微杆菌菌株，或所述微杆菌菌株的液体发酵上清液，或所述微杆菌菌株液体发酵上清液中的胞外酶。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中微杆菌菌株的浓度为od600值为1.0～1.2。
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