【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因调控，具体地说，涉及一种与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法。
技术介绍
1、淀粉作为高等植物中碳水化合物主要贮藏形式，同时也是粮食作物产品的最主要成分。影响马铃薯块茎淀粉含量的因素包括光合作用、蔗糖运输、块茎中淀粉的积累、植株本身对淀粉及其代谢物的消耗。马铃薯光合作用固定的碳源和能量通过蔗糖运输蛋白基因(sut1)进入块茎参与淀粉的合成。淀粉的合成和降解主要涉及腺苷二磷酸葡萄糖(adpg)焦磷酸化酶(淀粉合成的起始酶，催化葡萄糖—1—p形成adpg)、淀粉合成酶(将adpg的葡聚糖基转移到α—1,4－葡萄糖的非还原性末端)、淀粉分支酶(在直链淀粉上形成α—1,6分支点)、淀粉去分支酶(与分支酶的作用相反)、淀粉磷酸化酶和淀粉水解酶(将淀粉降解为葡萄糖单体)。
2、现有技术中的马铃薯种植过程中，往往只能够通过外在的因素进而影响所种植的马铃薯中的马铃薯的淀粉含量，这样对马铃薯中淀粉含量的调控方法往往是十分片面的，以及具有一定的局限性，对客观因素要求较高。
3、有鉴于此特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术目的之一在于，提供了一种与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，所述马铃薯statg3基因的cds如seq id no.1所示。
3、作为本技术方案的进一步改进，以通过所述马铃薯statg3基
4、作为本技术方案的进一步改进，包括以下步骤：
5、s1：制备含statg3片段的转化载体；
6、s2：转化农杆菌；
7、s3：以马铃薯野生种通过接入蔗糖8％和含活性炭的ms培养基中，培养至试管薯直径约0.5cm—0.6cm，获得马铃薯试管薯；
8、s4：获得稳定遗传转化的材料；
9、s5：将获得的株系分别扩繁，抽提基因组dna作为模板，通过pcr扩增及测序，确定转基因株系；
10、s6：对超量表达statg3的马铃薯株系的鉴定，获得阳性株系；
11、s7：对其阳性株系中statg3表达量的鉴定。
12、作为本技术方案的进一步改进，在所述s1中，所述制备含statg3片段的转化载体具体包括以下步骤：
13、s1.1：以根据statg3基因cdna序列(seq id no.1)作为超量片段，并以含有statg3片段的质粒为模板，引物为statg3—oe—f与statg3—oe—r；
14、s1.2：按照所述特定条件和时间进行pcr扩增，再进行凝胶电泳回收目的片段；
15、s1.3：配置t4连接酶反应体系，并混匀并室温孵育十分钟后置冰上；
16、s1.4：将dh5α感受态细胞置于冰上解冻，将反应产物加入到100μl感受态细胞中，并混匀，再冰上静置28min—32min；
17、s1.5：达到静置时间后，对其通过38℃—42℃的水浴热敷40s—50s，再立即置于冰上冷却105s—130s；
18、s1.6：加入900μl lb液体培养基，再进行50min—70min的37℃摇菌，然后再离心4min—6min；
19、s1.7：当离心完成后，弃上清，并用剩余培养基将菌体重悬，再用无菌涂布棒在含有20mg/ml—30mg/ml卡拉霉素的lb固体培养基平板上，最后倒置到温度为35℃—40℃培养箱中培养过夜；
20、s1.8：当培养过夜后，采用灭菌牙签挑取单菌落，再次将含有20mg/ml—30mg/ml卡拉霉素的lb固体培养基平板上，最后倒置到温度为35℃—40℃培养箱中再次培养过夜；
21、s1.9：完成培养后，以菌落为模板，引物p27—5(seq id no.4)与m13f(seq idno.5)，pcr扩增检测；
22、s1.10：在pcr扩增检测完成，分别挑取三个阳性克隆菌斑，再接入25ml—35ml含有20mg/ml—30mg/ml卡拉霉素的lb液体培养基中，以35℃—40℃和180rpm—220rpm转速培养过夜；
23、s1.11：最后经测序鉴定后获得含statg3片段的转化载体。
24、作为本技术方案的进一步改进，在所述s1.2和1.8中，对所述pcr扩增和pcr扩增检测均设置循环，且循环次数均为28次和32次，所述pcr扩增的每次循环条件及时间为，首先条件为90℃—100℃而时间为4min—6min，其次条件为90℃—100℃而时间为25s—35s，最后条件为55℃—65℃而时间为25s—35s，在循环完成后，再对其进行处理，其处理条件为70℃—74℃而时间为4min—6min。
25、作为本技术方案的进一步改进，在所述1.2中将所回收片段通过sma i与sac i进行双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，再通过凝胶电泳回收目的片段，然后将pbi121质粒通过sma i与sac i双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，最后通过凝胶电泳回收目的片段。
26、作为本技术方案的进一步改进，在所述1.3中，所述t4连接酶反应体系具体为，pcr片段酶切回收产物6μl，pbi121载体酶切回收产物2μl，盐溶液1μl，t4连接酶1μl；
27、在所述1.6中，所述50min—70min的37℃摇菌的转速为180rpm—220rpm，所述离心时的转速为4500rpm—5500rpm。
28、作为本技术方案的进一步改进，在所述s2中，所述转化农杆菌具体包括以下步骤：
29、s2.1：取—70℃至—90℃保存的农杆菌感受态插入冰中，至处于冰水混合状态；
30、s2.2：在每100μ1感受态加入1μg质粒dna，轻轻混匀；
31、s2.3：并依次于冰上静置4min—6min、液氮4min—6min、35℃—40℃水浴4min—6min、冰浴4min—6min；
32、s2.4：再加入650μl—700μl无抗生素的lb液体培养基，并25℃—30℃荡培养2h—3h，再通过5500rpm—6500rpm离心50s—70s收菌；
33、s2.5：当收菌完成后，留取80μl—120μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含20mg/ml—30mg/ml卡拉霉素的yeb平板上，并倒置放于温度为25℃—30℃培养箱培养48h—72h；
34、s2.6：当培养完成后，以菌落为模板，引物为p27—5(seq id no.4)与m13f(seq idno.5)，进行pcr扩增检测；
35、s2.7：pcr扩增检测完成后，挑取一个阳性克隆菌斑，并接入25ml—35本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与马铃薯淀粉含量相关的基因，其特征在于：所述马铃薯StATG3基因的CDS如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因用途，其特征在于：以通过所述马铃薯StATG3基因的CDS如SEQ ID No.1所示,超量表达马铃薯StATG3基因表达提高块茎淀粉含量。
3.应用于权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因的调控方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因的调控方法，其特征在于：在所述S1中，所述制备含StATG3片段的转化载体具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述S1.2和1.8中，对所述PCR扩增和PCR扩增检测均设置循环，且循环次数均为28次和32次，所述PCR扩增的每次循环条件及时间为，首先条件为90℃—100℃而时间为4min—6min，其次条件为90℃—100℃而时间为25s—35s，最后条件为55℃—65℃而时间为25s—35s，在循环完成后，再对其进行处理，其处理条件
6.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述1.2中将所回收片段通过Sma I与Sac I进行双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，再通过凝胶电泳回收目的片段，然后将pBI121质粒通过SmaI与Sac I双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，最后通过凝胶电泳回收目的片段。
7.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述1.3中，所述T4连接酶反应体系具体为，PCR片段酶切回收产物6μL，pBI121载体酶切回收产物2μL，盐溶液1μL，T4连接酶1μL；
8.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因的调控方法，其特征在于：在所述S2中，所述转化农杆菌具体包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述S2.6中，对PCR扩增检测设置循环，且循环次数为28次和32次，所述PCR扩增的每次循环条件及时间为，首先条件为90℃—100℃而时间为4min—6min，其次条件为90℃—100℃而时间为25s—35s，最后条件为55℃—65℃而时间为25s—35s，在循环完成后，再对其进行处理，其处理条件为70℃—74℃而时间为4min—6min。
10.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述S3中，所述培养条件为温度调节为18—20℃，光强条件为2000lx，培养时间为光照7h—9h+黑暗15h—17h。
11.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述S4中，所述获得稳定遗传转化的材料具体包括以下步骤：
12.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述S4.3中，所述当培养发生沉淀后，通过20mL MS液体培养基且蔗糖浓度2.5％至3.5％，对其重新悬浮；
13.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：所述对超量表达StATG3的马铃薯株系的鉴定，为将获得的株系分别扩繁，并抽提基因组DNA作为模板，通过PCR扩增及测序，确定转基因株系。
14.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：所述阳性株系中StATG3表达量的鉴定为通过荧光定量PCR检测目的基因表达量，以tublin基因表达量为内参，内参引物为β—tublin2—S：GATGTTGTGCCAAAGGATGT(SEQ ID No.6)与β—tublin2—R：AACTTGTGGTCAATGCGAGA(SEQ ID No.7)。
...【技术特征摘要】
1.一种与马铃薯淀粉含量相关的基因，其特征在于：所述马铃薯statg3基因的cds如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因用途，其特征在于：以通过所述马铃薯statg3基因的cds如seq id no.1所示,超量表达马铃薯statg3基因表达提高块茎淀粉含量。
3.应用于权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因的调控方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因的调控方法，其特征在于：在所述s1中，所述制备含statg3片段的转化载体具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述s1.2和1.8中，对所述pcr扩增和pcr扩增检测均设置循环，且循环次数均为28次和32次，所述pcr扩增的每次循环条件及时间为，首先条件为90℃—100℃而时间为4min—6min，其次条件为90℃—100℃而时间为25s—35s，最后条件为55℃—65℃而时间为25s—35s，在循环完成后，再对其进行处理，其处理条件为70℃—74℃而时间为4min—6min。
6.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述1.2中将所回收片段通过sma i与sac i进行双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，再通过凝胶电泳回收目的片段，然后将pbi121质粒通过smai与sac i双酶切，且双酶切条件为35℃—40℃而时间为14min—16min，最后通过凝胶电泳回收目的片段。
7.根据权利要求1所述的与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法，其特征在于：在所述1.3中，所述t4连接酶反应体系具体为，pcr片段酶切回收产物6μl，pbi121载体酶切回收产物2μl，盐溶液1μl，t4连接酶1μl；
8.根据权利要求1所述的与马铃薯淀...
【专利技术属性】
技术研发人员：何天久，吴巧玉，夏军辉，宋波涛，刘腾飞，
申请(专利权)人：贵州省生物技术研究所贵州省生物技术重点实验室，贵州省马铃薯研究所，贵州省食品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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