【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
1、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ap)是一类广泛催化磷酸单脂的水解，生成无机磷酸和相应的醇、酚及糖类化合物的非特异性磷酸单脂酶。
2、ap广泛存在于细菌、真菌及动物中，不同来源的ap的编码序列，空间结构及催化功能均有较大差异，分子量从51kda到800kda不等。比对大肠杆菌碱性磷酸酶(escherichiacoli ap,eap)和哺乳动物碱性磷酸酶(mammalian ap,map)的全序列，仅有25％～30％的同源性。不同ap的空间结构存在单体，二聚体和四聚体三种。eap的活性虽低于map，但其热稳定性良好，催化反应不依赖mg2+的浓度。ap作为一种工具酶在组织化学、免疫印迹等检测方面具有广泛应用。然而，eap酶活相对较低，生产成本高。
3、链霉亲和素对生物素和生物素化的分子均具有较强的特异性结合能力。单体链霉亲和素分子量为15kda，与天然重组链霉亲和素四聚体(55kda)相比，两者结合生物素的能力相当，但与生物素标记物的结合效果更佳，总体比四聚体更能有效避免空间位置的阻碍效应，同时还可以避免四聚链霉亲和素引起的交联效应而导致的聚集或沉淀。单体链霉亲和素的大小和单价特性在如功能性细胞表面标记和原子力光谱等应用中提供了优于四聚链霉亲和素的优势：单体链霉亲和素不会与生物素标记的细胞、抗原、抗体、核酸、蛋白、多肽、凝集素等分子结合时因交联而形成聚集或沉淀；具有良好的均一性，实验的可重复性更
4、目前，缺乏一种生产成本低、热稳定性好、酶活性高的碱性磷酸酶突变体及其制备方法。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的在于提供了一种活性高的保留ap酶活性和链霉亲和素结合活性的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白(eap-sa)及其制备方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的一种碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白，其中碱性磷酸酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，对大肠杆菌(escherichia coli strain k12)野生型碱性磷酸酶的关键结构域进行突变，突变位置如下：gln51leu,asp123ser,lys189arg,gly202ser,lys350leu,ser396cys,thr462ala。链霉亲和素蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，两者连接的linker的氨基酸序列如seqid no.3所示。
3、本专利技术编码碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白(eap-sa)的基因。以提高eap-sa在原核表达时的表达量，本专利技术还公开了一种针对大肠杆菌密码子优化后的eap-sa优化基因序列。
4、eap-sa基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，
5、进一步地，该基因序列根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化设计。其表达蛋白多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其表达效果如图3所示，其中上清组份中可溶性eap-sa融合蛋白表达量远高于沉淀组份。
6、本专利技术的一种包含碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白编码序列的重组表达载体。
7、本专利技术的一种包含重组表达载体的重组菌株。
8、本专利技术的一种重组表达载体的重组细胞。
9、进一步地，重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。并被重组表达载体所转化。
10、本专利技术的一种碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
11、(1)合成编码碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白基因序列；
12、(2)构建高效重组表达载体，得到重组质粒pcold-pelb-phoa-sa；
13、(3)用表达载体转化宿主菌bl21(de3)建构基因工程菌(重组细胞)；
14、(4)利用所获得的重组细胞的培养表达碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白；
15、(5)将步骤(4)所获得的表达产物的分离纯化，制得碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白。
16、进一步地，在步骤(2)中，并将合成的基因装配于克隆质粒puc18中，得到质粒puc18-pelb-phoa-sa，转化克隆大肠杆菌dh5α；
17、进一步地，在步骤(2)中，采用标准pcr技术扩增编码碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的基因，并在两端入加限制性酶切位点(kpn i,xba i)，限制酶酶切后，装在pcold iii载体相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pcold-pelb-phoa-sa；
18、编码基因的特异性引物对为phoa-sa-f/r；引物phoa-sa-f具有seq id no.5所示的核苷酸序列；引物phoa-sa-r具有seq id no.6所示的核苷酸序列。
19、采用标准pcr技术在片断的首尾引入合适的限制性酶切位点，装配入质粒pcoldiii转化宿主细胞，完成工程菌的构建。
20、将构建好的工程菌发酵，离心得到菌体，洗涤后破菌，离心收集上清，随后采用镍粒子亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白加入稳定剂后低温储存。
21、有益效果：本专利技术提供了一种保留ap酶活性和链霉亲和素结合活性的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白(eap-sa)。该融合蛋白eap-sa可在大肠杆菌中可溶性表达，生产成本低、热稳定性好、活性高。
22、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
23、(1)将碱性磷酸酶和链霉亲和素利用特殊的linker进行融合表达，保留了ap酶活性和链霉亲和素结合活性。
24、(2)碱性磷酸酶突变体的ap酶活性显著高于野生型；具有与生物素的结合活性和ap催化活性；该融合蛋白的ap酶比活力为70u/mg，与生物素的结合能力与链霉亲和素单体相当。
25、(3)碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白在原核表达系统中，多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其中上清组份中可溶性碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白表达量远高于沉淀组份。
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1.一种碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白，其特征在于：所述碱性磷酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述链霉亲和素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白两者连接的linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.包含权利要求2所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白编码序列的重组表达载体。
5.包含权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。
6.权利要求4所述的重组表达载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种权利要求1所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的碱性磷酸酶
10.根据权利要求9所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，采用标准PCR技术扩增碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白基因，并在两端入加限制性酶切位点(Kpn I,Xba I)，限制酶酶切后，装在pCold III载体相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pCold-PelB-phoA-SA；
...【技术特征摘要】
1.一种碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白，其特征在于：所述碱性磷酸酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述链霉亲和素融合蛋白的氨基酸序列如seq idno.2所示，所述碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白两者连接的linker的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.编码权利要求1所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.包含权利要求2所述的碱性磷酸酶突变体与链霉亲和素融合蛋白编码序列的重组表达载体。
5.包含权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。
6.权利要求4所述的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洋，汪寄宇，
申请(专利权)人：上海馨瑷生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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