本发明专利技术公开了一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量PCR引物组合及其试剂盒。所述荧光定量PCR引物组合包括三种亚群PCR引物组合和ALV‑K亚群引物组合，所述三种亚群PCR引物组合包括特异性扩增ALV‑A，ALV‑B和ALV‑J亚群的引物对ALV‑ABJ‑F、ALV‑ABJ‑R1、ALV‑ABJ‑R2和探针ALV‑ABJ‑P1和探针ALV‑ABJ‑P2；所述双重荧光定量PCR检测试剂盒包括上述荧光定量PCR引物组合。本发明专利技术可以快速精准的检测国内流行的外源性禽白血病A，B和J亚群以及新出现的K亚群，为国内ALV的精准净化提供了高效、便捷和可靠的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及禽白血病病毒检测领域，具体涉及一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量pcr引物组合及其试剂盒。
技术介绍
1、禽白血病病毒(avian leukosis virus,alv)是一种具有传染性的反转录病毒，可以引起家禽不同组织的肿瘤疾病、免疫抑制和生产性能下降，alv整合到宿主基因组和垂直传播的特性，保持了alv在种群内的延续性，对养禽业造成了巨大的经济损失。根据alv包膜糖蛋白的不同，可以将alv分为a-k共11个亚群，其中鸡对alv的a，b，c，d，e，j和k亚群易感。alv-e亚群是内源性alv，无致癌基因，致病性很低，感染鸡后几乎不会发病，也不会产生明显的临床症状，对种群的危害有限。目前没有针对禽白血病有效的商品化疫苗和特效药可用，因此通过抗原检测的方法，以淘汰和净化获得无alv的种鸡群是目前养禽业防控alv的主要手段。
2、早期国内流行的外源性alv血清型主要是a和b亚群，主要引起鸡的淋巴肉瘤白血病，后来在从国外引种的过程中引入了alv-j亚群，由于当时的检测手段缺乏，使得j亚群很快在国内蔓延开来。k亚群则是近年来在国内新发现的一个亚群，具有与其他外源性白血病不同的env基因，所以以env基因为靶标的alv检测技术无法检测到alv-k亚群的抗原。alv-k亚群的出现无疑给alv的检测和净化带来了新的挑战。
3、因此，建立一种能够快速、精准和灵敏的检测常见外源性禽白血病(abjk亚群)的方法对于alv的防控和净化具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有的外源性alv检测方法(abj亚群)无法覆盖国内流行毒株，因而无法满足种鸡群alv检测和净化的需求，提供了一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量pcr引物组合及其试剂盒。本专利技术的荧光定量pcr引物组合及其试剂盒能够快速、精准和灵敏的且同时检测目前国内流行的外源性alv-a、alv-b、alv-j和alv-k亚群。
2、为实现上述目的，本专利技术所设计的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量pcr引物组合，所述荧光定量pcr引物组合包括三种亚群pcr引物组合和alv-k亚群引物组合，所述三种亚群pcr引物组合包括特异性扩增alv-a，alv-b和alv-j亚群的引物对alv-abj-f、alv-abj-r1、alv-abj-r2和探针alv-abj-p1和探针alv-abj-p2；其中，
4、alv-abj-f：5’-ttattwggaaggcaacagacgg-3’，(seq id no.1)
5、alv-abj-r1：5’-tgctcgtagtcgtcagggaatc-3’，(seq id no.2)
6、alv-abj-r2：5’-tgttcgcaatcgttagggaatc-3’，(seq id no.3)
7、alv-abj-p1：5’-aacgccattttacctyycaccacat-3’，(seq id no.4)
8、alv-abj-p2：5’-cgccatttgaccattcaccacattg-3’，(seq id no.5)
9、alv-abj-p1和alv-abj-p2的5’端均设有报告基团，3’端均设有淬灭基团；
10、所述alv-k亚群引物组合包括特异性扩增alv-k亚群的引物对alv-k-f、alv-k-r和探针alv-k-p；其中，
11、alv-k-f：5’-kcacagacaggtyctcgcttcc-3’，(seq id no.6)
12、alv-k-r：5’-aaactgaacggctytgtctcgtt-3’，(seq id no.7)
13、alv-k-p：5’-acccathtacctcctgtgcgtgtgc-3’(seq id no.8)
14、alv-k-p的5’端设有报告基团，3’端设有淬灭基团。
15、进一步地，所述alv-abj-p1和alv-abj-p2的5’端的报告基团均为fam，alv-abj-p1和alv-abj-p2的3’端的淬灭基团为bhq-1；
16、alv-k-p的报告基团均为hex，淬灭基团为bhq-1。
17、本专利技术还提供了一种基于taqman探针法的双重荧光定量pcr检测试剂盒，所述双重荧光定量pcr检测试剂盒包括上述荧光定量pcr引物组合。
18、进一步地，所述试剂盒还包括用于建立荧光定量pcr反应体系的2×probe qpcrsupermix预混液。
19、本专利技术还提供了一种用于检测外源性禽白血病病毒(abjk亚群)荧光定量pcr方法，其特征在于：包括以下步骤：
20、1)提取待检测样品的dna；
21、2)以待检测样品的dna为模板，使用权利要求3所述试剂盒中荧光定量pcr引物组合在一个反应体系内进行多重荧光定量pcr扩增反应；
22、3)荧光定量pcr产物的结果分析：
23、当待检测样品fam通道扩增结果出现典型s型扩增曲线且ct<38时，则表明样品中含有禽白血病a/b/j亚群病毒核酸的一种或几种(当ct<30时，则相应病毒核酸检测为强阳性)；
24、当待检测样品hex通道扩增结果出现典型s型扩增曲线且ct<38时，则表明样品中含有禽白血病k亚群病毒的核酸；fam通道或者hex通道任一通道检测阳性，则判定样品中含有外源性禽白血病病毒
25、或者，当待检测样品fam通道和hex通道扩增结果无明显扩增曲线，则表明样品中不含有禽白血病a/b/j/k亚群的病毒核酸，则待检测样品中不含有外源性禽白血病病毒。
26、或者，当待检测样品扩增结果出现典型s型扩增曲线且ct≥38时，则该荧光通道对应的病毒核酸检测结果存疑，建议重新检测。
27、进一步地，所述重新检测的结果如下：
28、若再次扩增结果仍出现典型s型扩增曲线，则该荧光通道对应的病毒核酸检测结果呈弱阳性；则待检测样品中含有外源性禽白血病病毒。
29、或者，若再次扩增结果无明显扩增曲线，则该荧光通道对应的病毒核酸检测结果为阴性。
30、再进一步地，所述步骤2)中，pcr反应体系总体积为25μl，且pcr反应体系中，2×probe qpcr supermix预混液12.5μl，模板1μl，
31、所述alv-abj-f，alv-abj-r1和alv-abj-r2的终浓度均为0.1μm，所述alv-k-f和alv-k-r的终浓度为0.2μm，所述alv-abj-p1和alv-abj-p2的终浓度为0.1μm，所述alv-k-p的终浓度为0.2μm，
32、pcr反应条件：
33、95℃预变性2min，95℃变性8s，45个循环，60℃退火40s，45个循环(在退火阶段采集本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量PCR引物组合，其特征在于：所述荧光定量PCR引物组合包括三种亚群PCR引物组合和ALV-K亚群引物组合，所述三种亚群PCR引物组合包括特异性扩增ALV-A，ALV-B和ALV-J亚群的引物对ALV-ABJ-F、ALV-ABJ-R1、ALV-ABJ-R2和探针ALV-ABJ-P1和探针ALV-ABJ-P2；其中，
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR引物组合，其特征在于：所述ALV-ABJ-P1和ALV-ABJ-P2的5’端的报告基团均为FAM，ALV-ABJ-P1和ALV-ABJ-P2的3’端的淬灭基团为BHQ-1；
3.一种基于TaqMan探针法的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述双重荧光定量PCR检测试剂盒包括权利要求1所述荧光定量PCR引物组合。
4.根据权利要求3所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于建立荧光定量PCR反应体系的2×Probe qPCR SuperMix预混液。
5.一种用于检测外源性禽白血病病毒荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重新检测的结果如下：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，
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【技术特征摘要】
1.一种用于检测外源性禽白血病病毒的荧光定量pcr引物组合，其特征在于：所述荧光定量pcr引物组合包括三种亚群pcr引物组合和alv-k亚群引物组合，所述三种亚群pcr引物组合包括特异性扩增alv-a，alv-b和alv-j亚群的引物对alv-abj-f、alv-abj-r1、alv-abj-r2和探针alv-abj-p1和探针alv-abj-p2；其中，
2.根据权利要求1所述的荧光定量pcr引物组合，其特征在于：所述alv-abj-p1和alv-abj-p2的5’端的报告基团均为fam，alv-abj-p1和alv-abj-p2的3’端的淬灭基团为bhq-1；<...
【专利技术属性】
技术研发人员：张安定，易辰阳，张玮瑾，吴月，靳泽华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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