【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学实验，尤其涉及一种高质高量云南松枝条总dna提取方法。
技术介绍
1、云南松(pinus yunnanensis)是我国西南地区特有的乡土树种，广泛分布于云南、贵州、四川等地。由于生长快、抗旱性强、耐瘠薄、能提供优质木材和树脂等特性，云南松成为西南地区主要的用材树种和荒山绿化先锋树种。在分布区内，其森林面积约占森林总面积的52％，木材产量占木材蓄积量的32％，因此云南松对于促进西南地区经济发展和绿色生态维护具有重要意义。进一步促进云南松优质高产新品种培育具有重大意义，与云南松材性性状相关联的分子调控基因及分子标记的研究刻不容缓。
2、云南松进行分子遗传研究，首要一步就要提取到高质高量的dna。dna没有提出来或者提出来的dna杂质太多，将严重影响后续分子研究。云南松dna的提取通常是采集春季幼嫩针叶，采用常规2×ctab法提取，然而在前期的实验中我们发现即使采用春季幼嫩针叶提取到的dna，因其含有较多杂质，致使后续的pcr扩增成功率低，易导致实验失败。并且进一步的研究表明随着季节的推移，利用幼嫩针叶提取dna成功率在逐渐下降，到了秋冬季幼嫩针叶，采用4×ctab，进口试剂盒等方法，都无法提出电泳能检测得到的长片段dna。通过超微量分光光度计检测dna溶液中dna的浓度和纯度，我们发现电泳检测到针叶弥散状dna溶液中dna含量低且杂质含量高，这说明随着季节的推移，云南松针叶中的dna会发生自己降解。dna严重降解且杂质含量高会致使有效分子数据量捕获效率降低，严重影响科研结论的完整性和正确性。p>
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在dna严重降解且杂质含量高会致使有效分子数据量捕获效率降低，严重影响科研结论的完整性和正确性的缺点，而提出的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，包括以下步骤：
4、步骤一、树枝条硅胶干燥：野外采集带有芽的枝条，弃芽后剪段装入盛有硅胶的密封袋中，带回实验室室温干燥；
5、步骤二、液氮研磨：用锋利剪刀将枝条剪碎，在研钵中放入少量pvp和适量的液氮将枝条研磨至粉末状；
6、步骤三、木粉过筛：研磨好的木粉过100目筛后装入2.0ml灭菌离心管；
7、步骤四、裂解释放dna：加入裂解液，水浴对粉末状样品进行裂解释放dna；
8、步骤五、抽提dna：利用苯酚、氯仿和异戊醇对经过裂解消化处理的样本进行dna抽提；
9、步骤六、挑取dna：利用冰冻无水乙醇沉淀dna时候，用灭菌枪头挑取絮状dna至1.5ml灭菌离心管中；
10、步骤七、洗涤dna：用75％的乙醇清洗dna；
11、步骤八、溶解dna：清洗干净的dna室温风干后，加入灭菌ddh2o于4℃冰箱中溶解；
12、步骤九、检测dna：通过琼脂糖凝胶电泳直观检测dna；通过超微量分光光度计检测dna浓度和纯度。
13、优选的，所述步骤一中，枝条为侧枝幼嫩带芽枝条，硅胶袋为7号袋，硅胶盛满至袋子体积的4/5；样本带回实验室室温干燥时间需约2周，期间发现硅胶变色为粉红色应及时更换硅胶。
14、优选的，所述步骤二中，向直径为10cm装有剪碎枝条的陶瓷研钵中加入适量液氮，利用液氮对枝条进行预冷却，待研钵中液氮快蒸发完时，快速顺时针方向研磨样本，然后补充液氮，再次研磨，直至把样本研磨成粉状。
15、优选的，所述步骤三中，步骤二中研磨好的木粉过100目筛后，细粉称取约0.1g装入2.0ml灭菌离心管。
16、优选的，所述步骤四中，所述4×ctab包括如下步骤制备：
17、将20ml ph为8.0浓度为1m的tris-hcl缓冲液、56ml浓度为5m的nacl，8ml ph为8.0浓度为0.5m的edta缓冲液和8g ctab混合溶解后加灭菌水定容至200ml，得4×ctab溶液。
18、所述dna裂解液由4×ctab、60mg/ml纤维素酶、20mg/ml蛋白酶k、20％ pvp和99％β-巯基乙醇，体积比为1000:20:30:200:50；裂解温度为水温65℃，水浴时间为3h。
19、优选的，所述步骤五中，需制备苯酚-三氯甲烷异-戊醇混合液，其体积比为25:24:1；三氯甲烷-异戊醇混合液，其体积比为：24:1。步骤四dna裂解后的液体，12000rpm离心10min，用枪头吸取液体，加入等体积苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，摇床上轻摇20min，12000rpm离心10min，取上清于2.0ml灭菌离心管中，加入等体积三氯甲烷-异戊醇混合液，摇床上轻摇20min，12000rpm离心10min，取上清转入2.0ml灭菌离心管中。
20、优选的，所述步骤六中，加入2倍体积-20℃冰冻无水乙醇，并轻轻上下混均液体沉淀dna，随即用灭菌200μl移液器黄色吸头挑取絮状dna至1.5ml灭菌离心管中。
21、优选的，所述步骤7中，加入1.0ml-20℃冰冻75％乙醇于dna离心管中，轻轻上下颠倒洗涤dna 10min，4℃，12000rpm离心10min，轻轻倒掉乙醇，再次加入1.0ml-20℃冰冻75％乙醇于dna离心管中，上下颠倒洗涤dna 10min，4℃，12000rpm离心10min。
22、优选的，所述步骤8中，清洗干净的dna室温风干5小时，加入100μl灭菌ddh2o于4℃冰箱中过夜溶解。
23、本专利技术中，所述一种高质高量云南松枝条总dna提取方法的有益效果：
24、1、本专利技术选树枝作为提取dna的材料，其dna含量比针叶丰富，选材客观理性，并且枝条采用硅胶干燥的方法，野外样本保存适用性强；
25、2、本专利技术用液氮研磨后的木粉过100目筛可以得到更细的木粉，有利于后面裂解液中dna的裂解释放；
26、3、本专利技术裂解液以4×ctab为基础，根据云南松枝条特性，加入纤维素酶、蛋白酶k、pvp和β-巯基乙醇，并且水浴时间从常规的1h增加到3h，保证了云南松枝条中dna的充分裂解释放；
27、4、本专利技术用冰冻无水乙醇沉淀dna步骤时，摒弃常规的dna连同杂质离心沉淀法，采用直接挑取絮状dna法，使dna完全脱离杂质，经过后期的洗涤，dna的纯度较高；
28、5、本专利技术提取到的dna无论数量和质量都显胜于常规的2×ctab法和全式金生物试剂盒提取到的dna，完全能满足后续的各类pcr反应，为保证云南松分子生物学研究顺利开展奠定基础；
29、6、本专利技术不受季节采样影响，可以提取到高质高量dna，为其他木材树种枝条dna的提取提供了一种新的方法。
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1.一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤一中，枝条为侧枝幼嫩带芽枝条，硅胶袋为7号袋，硅胶盛满至袋子体积的4/5；样本带回实验室室温干燥时间需2周，期间发现硅胶变色为粉红色应及时更换硅胶。
3.根据权利要求2所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤二中，向直径为10CM装有剪碎枝条的陶瓷研钵中加入液氮，利用液氮对枝条进行预冷却，待研钵中液氮快蒸发完时，快速顺时针方向研磨样本，然后补充液氮，再次研磨，直至把样本研磨成粉状。
4.根据权利要求3所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤三中，步骤二中研磨好的木粉过100目筛后，细粉称取0.1g装入2.0mL灭菌离心管。
5.根据权利要求4所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤四中，所述4×CTAB包括如下步骤制备：
6.根据权利要求5所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征
7.根据权利要求6所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤六中，加入2倍体积-20℃冰冻无水乙醇，并轻轻上下混均液体沉淀DNA，随即用灭菌200μL移液器黄色吸头挑取絮状DNA至1.5mL灭菌离心管中。
8.根据权利要求7所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤7中，加入1.0mL-20℃冰冻75％乙醇于DNA离心管中，轻轻上下颠倒洗涤DNA 10min，4℃，12000rpm离心10min，轻轻倒掉乙醇，再次加入1.0mL-20℃冰冻75％乙醇于DNA离心管中，上下颠倒洗涤DNA 10min，4℃，12000rpm离心10min。
9.根据权利要求8所述的一种高质高量云南松枝条总DNA提取方法，其特征在于，所述步骤8中，清洗干净的DNA室温风干5小时，加入100μL灭菌ddH2O于4℃冰箱中过夜溶解。
...【技术特征摘要】
1.一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，所述步骤一中，枝条为侧枝幼嫩带芽枝条，硅胶袋为7号袋，硅胶盛满至袋子体积的4/5；样本带回实验室室温干燥时间需2周，期间发现硅胶变色为粉红色应及时更换硅胶。
3.根据权利要求2所述的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，所述步骤二中，向直径为10cm装有剪碎枝条的陶瓷研钵中加入液氮，利用液氮对枝条进行预冷却，待研钵中液氮快蒸发完时，快速顺时针方向研磨样本，然后补充液氮，再次研磨，直至把样本研磨成粉状。
4.根据权利要求3所述的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，所述步骤三中，步骤二中研磨好的木粉过100目筛后，细粉称取0.1g装入2.0ml灭菌离心管。
5.根据权利要求4所述的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，所述步骤四中，所述4×ctab包括如下步骤制备：
6.根据权利要求5所述的一种高质高量云南松枝条总dna提取方法，其特征在于，所述步骤五中，需制备苯酚-三氯甲烷异-戊醇混合液，其体积比为25:24:1；三氯甲烷-异戊醇混合液，其体积比为：24:1；步...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪迎春，崔凯，李仲牧，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院高原林业研究所，
类型：发明
国别省市：
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