【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7及其制备与应用。
技术介绍
1、氨基葡萄糖苷及其衍生物具有重要的经济价值，可广泛应用于医药大健康领域和食品加工行业等。现有文献1（liu et al. revisiting glycoside hydrolase family 20β-n-acetyl-d-hexosaminidases: crystal structures, physiological substratesand specific inhibitors, biotechnol adv, 2018, 36(4): 1127–1138）公开氨基葡萄糖苷及其衍生物预防和治疗骨关节慢性炎症疾病，促进软骨损伤的愈合，改善肠道消化吸收功能，调节胎儿心脏的生长发育；也可用于生产唾液酸、生物乙醇和单细胞蛋白质等。文献2（ma et al. categories and biomanufacturing methods of glucosamine, applmicrobiol biot, 2019,103(19):7883–7889）公开乙酰氨基葡萄糖苷酶（glcnacases，n-acetyl-glucosaminidases，ec 3.2.1.52）作为生物制备法生产氨基葡萄糖苷及其衍生物的关键酶制剂之一，可协同几丁质酶降解富含几丁质的环境废弃物，如虾壳或真菌菌丝体等。文献3（zhang et al. enzymatic properties of β-n-acetylglucosaminid
2、hj5nag是一种高活性、耐产物抑制的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶，但是其最适温度为45℃，35℃仅为最高酶活力的50%左右，而相似的温度下其热稳定性较差，在37℃下处理1h剩余酶活力仅为11%，最适温度和热稳定性的不一致，极大限制了其生产功能性乙酰氨基葡萄糖苷的应用。
3、因此，利用蛋白质工程改造野生酶hj5nag，提高其在最适温度的热稳定性，有利于其在功能性食品生产领域，具有重要的应用意义和经济价值。
技术实现思路
1、专利技术的目的是提供一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7及其制备与应用，解决了野生型n-乙酰氨基葡萄糖苷酶在最适温度附近的热稳定性差的问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7，该突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术提供了一种如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术提供了一种包含如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因的重组表达载体。
5、优选地，所述的重组表达载体选自peasy-e2。
6、本专利技术提供了一种包含如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因的重组表达菌。
7、优选地，所述的重组表达菌选自大肠杆菌bl21(de3)。
8、本专利技术提供了一种如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的制备方法，包含以下步骤：
9、（1）以含有野生酶编码基因如seq id no.4所示核苷酸序列的重组质粒为模板，采用核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6突变引物对进行突变扩增，得到含有如seq idno.2所示核苷酸序列的突变体编码基因的重组质粒；
10、（2）将步骤（1）得到的重组质粒转化至大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞，获得转化子，筛选阳性克隆，即得到重组表达菌；
11、（3）培养步骤（2）得到的重组表达菌接种至lb液体培养基中，进行诱导表达，纯化得到所述n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7。
12、本专利技术提供了一种如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7或如所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因在功能性食品生产领域中的应用。
13、本专利技术提供了一种如所述的重组表达载体在功能性食品生产领域中的应用。
14、本专利技术提供了一种如所述的重组表达菌在功能性食品生产领域中的应用。
15、本专利技术的一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7及其制备与应用，解决了野生型n-乙酰氨基葡萄糖苷酶在最适温度附近的热稳定性差的问题，具有以下优点：
16、本专利技术利用基因工程技术，提供了一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7，其最适温度为35℃，在37℃耐受1h后仍能保持53%以上的酶活。与野生酶相比，de259aδ7最适温度下降了10℃，且其在37℃耐受1h后的剩余酶活提升了42%。本专利技术的突变体有利于拓宽其在功能性食品生产领域的应用，具有广泛的应用前景。
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1.一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7，其特征在于，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体选自pEASY-E2。
5.一种包含如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于，所述的重组表达菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
8.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7或如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基
9.一种如权利要求3所述的重组表达载体在功能性食品生产领域中的应用。
10.一种如权利要求5所述的重组表达菌在功能性食品生产领域中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7，其特征在于，该突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种包含如权利要求2所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体选自peasy-e2。
5.一种包含如权利要求2所述的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体de259aδ7的编码基因的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵敏，李芳，孙龙，张蕊，杨攀丽，常晓凤，周峻沛，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院高原林业研究所，
类型：发明
国别省市：
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