【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、基于巨细胞病毒(cmv)的疫苗载体利用该病毒的天然能力来引起和维持循环和组织驻留效应分化t细胞，包括早期hiv感染的潜在位点。例如，编码猿猴免疫缺陷病毒(siv)抗原插入片段的恒河猴cmv(rhcmv)载体可以(1)重复感染rhcmv免疫灵长类动物，并在淋巴和器官组织两者中引起高频效应子分化的siv特异性cd4+和cd8+ t细胞，(2)无限期地维持这些应答，并且(3)表现出早期严格控制和最终清除高致病性sivmac239菌株的感染。目前的cmv制造过程产量有限，并且无法直接扩展。从疫苗载体中缺失必需的病毒基因是确保临床安全的惯常做法。然而，为了产生具有必需基因缺失的载体，必须采用某种基因互补方法。标准方法涉及创建表达必需病毒基因或其功能等同物的稳定细胞系，然而，hcmv的生产由于需要原代正常二倍体细胞来生产病毒而变得复杂。因此，仍然需要能够生成基于cmv载体的疫苗的制造方法，这些制造方法可以产生临床和商业用途所需量的疫苗。本文描述了一种利用mrna转染将必需病毒基因递送至宿主细胞以实现cmv载体的规模化生产的方法。p>
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【技术保护点】
1.一种产生子代巨细胞病毒(CMV)的方法，所述方法包括：
2.一种产生子代CMV的方法，所述方法包括：
3.一种产生子代CMV的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其中CMV复制所必需的或增强CMV复制的所述基因是UL82、UL32、UL34、UL37、UL44、UL46、UL48、UL48.5、UL49、UL50、UL51、UL52、UL53、UL54、UL55、UL56、UL57、UL60、UL61、UL70、UL71、UL73、UL75、UL76、UL77、UL79、UL80、UL84、UL85、UL86、U...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生子代巨细胞病毒(cmv)的方法，所述方法包括：
2.一种产生子代cmv的方法，所述方法包括：
3.一种产生子代cmv的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其中cmv复制所必需的或增强cmv复制的所述基因是ul82、ul32、ul34、ul37、ul44、ul46、ul48、ul48.5、ul49、ul50、ul51、ul52、ul53、ul54、ul55、ul56、ul57、ul60、ul61、ul70、ul71、ul73、ul75、ul76、ul77、ul79、ul80、ul84、ul85、ul86、ul87、ul89、ul90、ul91、ul92、ul93、ul94、ul95、ul96、ul98、ul99、ul100、ul102、ul104、ul105、ul115或ul122，或其同源物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述子代cmv包含pp71蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是mrc-5细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:14的序列。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:14-20中的一者的序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:4-10中的一者的序列。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:4的序列。
11.根据权利要求1至6、9和10中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seqid no:4-10中的一者的序列，其中每个尿苷被假尿苷取代并且每个胞苷被5-甲基胞苷取代。
12.根据权利要求1至6、9和10中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seqid no:4-10中的一者的序列，其中每个尿苷被5-甲氧基尿苷取代。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:21-27中的一者的序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述mrna分子进一步包含poly(a)尾。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中poly(a)尾已被添加至编码所述pp71蛋白的所述mrna分子的3'末端。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述mrna分子是使用编码所述poly(a)尾的双链dna模板产生的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双链dna模板是质粒。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述poly(a)尾为约60-100个核苷酸长。
19.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述poly(a)尾为80个核苷酸长。
20.根据权利要求1至8和14至19中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seqid no:14-20中的一者的序列，其中每个尿苷被假尿苷取代并且每个胞苷被5-甲基胞苷取代，并且具有长度为80个核苷酸的poly(a)尾。
21.根据权利要求1至6、9至11和14至19中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:4-10中的一者的序列，其中每个尿苷被假尿苷取代并且每个胞苷被5-甲基胞苷取代，并且具有长度为80个核苷酸的poly(a)尾；并且其中所述poly(a)尾是使用质粒模板产生的。
22.根据权利要求1至6、9、12和14至19中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seq id no:4-10的序列，其中每个尿苷被5-甲氧基尿苷取代，并且具有长度为80个核苷酸的poly(a)尾；其中所述poly(a)尾是使用质粒模板产生的。
23.根据权利要求1至6和13至19中任一项所述的方法，其中所述mrna分子包含根据seqid no:21-27的序列，其中每个尿苷被5-甲氧基尿苷取代，并且具有长度为80个核苷酸的poly(a)尾。
24.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述poly(a)尾是在转录后通过酶添加的或已经在转录后通过酶添加。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述poly(a)尾为约50-100个核苷酸长。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述mrna分子是使用转染引入的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述转染是使用脂质转染试剂完成的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述脂质转染试剂包括messengermax、lipofectamine 2000、jet-mrna或trans-it。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述mrna分子以5ng/cm2至500ng/cm2的剂量递送。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述mrna分子以50ng/cm2至100ng/cm2的剂量递送。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述mrna分子以50ng/cm2的剂量递送。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述mrna分子以100ng/cm2的剂量递送。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述亲本或子代cmv是hcmv。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述亲本或子代cmv是hcmv的经基因修饰的tr菌株。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述亲本或子代cmv包含tr3骨架。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述亲本或子代cmv包含编码异源抗原的核酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述异源抗原包括病原体特异性抗原或肿瘤抗原。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述异源抗原包括病原体特异性抗原，所述病原体特异性抗原包括人免疫缺陷病毒(hiv)抗原、猿猴免疫缺陷病毒(siv)抗原、人巨细胞病毒(hcmv)抗原、乙型肝炎病毒(hbv)抗原、丙型肝炎病毒(hcv)抗原、乳头瘤病毒抗原(例如，人乳头瘤病毒(hpv)抗原)、疟原虫抗原、卡波西肉瘤相关疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒(vzv)抗原、埃博拉病毒、结核分枝杆菌抗原、基孔肯雅病毒抗原、登革热病毒抗原、猴痘病毒抗原、单纯疱疹病毒(hsv)1抗原、单纯疱疹病毒(hsv)2抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、流感病毒抗原或破伤风梭菌抗原。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述异源抗原包括hiv抗原。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述hiv抗原是gag、pol、nef、env、tat、rev、tat、vpr、vif或vpu，或其表位或抗原片段。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述hiv抗原包含gag、pol、nef、env、tat、rev、tat、vpr、vif和vpu或其表位或抗原片段中的多于一者。
42.根据权利要求39所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·勒杜克斯，E·布鲁宁，J·L·道格拉斯，C·R·迈耶，
申请(专利权)人：维尔生物科技公司，
类型：发明
国别省市：
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