【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗领域，主要涉及抑制ccr2基因表达的sirna以及装载sirna的纳米粒子及其用途。
技术介绍
1、在过去的几十年中，癌症研究主要集中在恶性细胞和相关基因调控上，而最近，肿瘤微环境(tme)的概念已被广泛接受。肿瘤与其微环境之间的动态相互作用被认为对致癌作用具有显著影响，同时也很大程度影响了肿瘤发生发展的进程以及。除肿瘤细胞外，tme还由多种非恶性细胞组成，如成纤维细胞、间充质干细胞、血淋巴内皮细胞和大量浸润性白细胞。其中一些细胞可以上调ccl2表达并参与肿瘤进展。近年来，越来越多的研究显示，肿瘤细胞处于一种免疫耐受状态，除了pd-l1、ctla-4免疫检查点外，ccr2也是一个促进肿瘤耐受的基因。ccr2(c-c motif chemokine receptor 2,cc趋化因子受体2)是趋化因子配体ccl2的受体，其在髓系抑制性细胞(mdscs)表面高表达。有报道认为ccr2信号似乎通过破坏树突状细胞的成熟来实现免疫抑制，树突状细胞是最重要的抗原呈递细胞，对免疫应答的启动至关重要。与表达ccr2的癌细胞相比，由不表达ccr2的细胞所产生的肿瘤中，成熟树突状细胞和活化的cd8+杀伤t细胞的浸润性更高。目前认为肿瘤细胞的ccr2基因可以作为一个潜在靶点。
2、小核酸药物通过反义原理靶向rna可使特定疾病基因沉默，达到治疗目的，作为一种治疗策略，具有高特异性、高效性、长效性等优势，大大扩展了可用于治疗的靶点的数量和类型，而高效的递送系统是小核酸药物研发和运用的关键。目前，小核酸药物在实际应用过程中
3、抗菌肽，又称为宿主防御肽(host defense peptides,hdps)，一般由12到100个氨基酸残基组成，是一类碱性多肽，大部分的抗菌肽带正电荷。dp7多肽(vqwrirvavirk)是用计算机辅助设计新型抗菌肽的筛选方法，通过对模板抗菌肽hh2替换了2个氨基酸得到的具有更高的细菌识别特异性与更强的抗菌活性的抗菌肽。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是为抗肿瘤免疫治疗提供一种新的有效选择。
2、为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种抑制ccr2基因表达的sirna。该sirna的序列如下：
3、正义链:5’-gcaacauguuggucauuautt-3’
4、反义链:5’-auaaugaccaacauguugctt-3’。
5、本专利技术还提供了上述抑制ccr2基因表达的sirna在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌或者结肠癌中的至少一种。
6、本专利技术还提供了一种装载了上述的sirna的纳米粒子。该纳米粒子是由疏水化修饰的多肽装载上述的抑制ccr2基因表达的sirna制备而成；所述多肽的序列为vqwrirvavirk，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
7、其中，上述装载sirna的纳米粒子中所述的多肽vqwrirvavirk碳端酰胺化修饰为vqwrirvavirk-nh2。
8、其中，上述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg或peg衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为c6-c20中的至少一种。
9、其中，上述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的peg衍生物为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
10、其中，上述多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-co-oh与多肽上的-nh2酰胺化反应生成。优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：
11、
12、进一步的，上述多肽结构中的r为：
13、
14、
15、中的至少一种。
16、其中，上述装载sirna的纳米粒子中所述的疏水化修饰多肽和小核酸按质量比3～6︰1作为原料制备而成。优选的，上述疏水化修饰多肽和小核酸按质量比为5︰1。
17、进一步的，上述装载sirna的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与sirna共孵育制得。
18、其中，上述装载sirna的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与sirna在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得。所述液态培养基为rpmi 1640、dmem双无培养基或optim培养基中的至少一种。
19、具体的，本专利技术方法包括以下步骤：
20、a、称取适量dp7-c粉末，加入灭菌水溶解，自发形成胶束
21、b、将ccr2靶点基因的sirna按照质量比为(dp7-c:sirna＝3:1～5:1)室温孵育15-20min，即得到dp7-c/sirna复合物。
22、本专利技术还提供了上述的抑制ccr2基因表达的sirna或上述的装载sirna的纳米粒子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
23、进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌或者结肠癌中的至少一种。
24、本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，是由上述的抑制ccr2基因表达的sirna或上述的装载sirna的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。进一步的上述药物还可以含有药学上可以接受的辅助性成分。
25、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一个效果很好的，针对ccr2基因的sirna分子。本专利技术ccr2 sirna能高效抑制ccr2基因的表达，mrna水平显著下调，可达75％以上，蛋白表达得到明显抑制，抑制率可达到75％，有显著的抑制肿瘤的功能。本专利技术还进一步地使用了抗菌肽衍生物dp7-c作为sirna递送载体。本专利技术还针对ccr2基因提供了基于dp7-c小核酸递送系统，原位瘤内注射dp7-c/ccr2 sirna复合物可以用于小鼠结直肠癌及黑色素瘤的治疗。本专利技术涉及到的dp7-c胶束除了高效的sirna递送能力，其在体内外均本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抑制CCR2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列如下：
2.权利要求1所述的抑制CCR2基因表达的siRNA在制备治疗肿瘤的药物中的用途，进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌或者结肠癌中的至少一种。
3.装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰的多肽装载权利要求1所述的抑制CCR2基因表达的siRNA制备而成；所述多肽的序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.3)，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段；优选的，所述的多肽VQWRIRVAVIRK碳端酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
4.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG或PEG衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的PEG衍生物为1，2-二油酰
6.根据权利要求3～5任一项所述所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成；优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：
7.根据权利要求3～6任一项所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的疏水化修饰多肽和小核酸按质量比3～6︰1作为原料制备而成。
8.根据权利要求3～7任一项所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰的多肽与siRNA共孵育制得；进一步的，是由疏水化修饰的多肽与siRNA在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得；更进一步的，所述液态培养基为RPMI 1640、DMEM双无培养基或Optim培养基中的至少一种。
9.权利要求3～8任一项所述的装载siRNA的纳米粒子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌或者结肠癌中的至少一种。
11.抗肿瘤药物，其特征在于由权利要求1所述的抑制CCR2基因表达的siRNA或权利要求3～9任一项所述的装载siRNA的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。
...【技术特征摘要】
1.抑制ccr2基因表达的sirna，其特征在于，所述sirna序列如下：
2.权利要求1所述的抑制ccr2基因表达的sirna在制备治疗肿瘤的药物中的用途，进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌或者结肠癌中的至少一种。
3.装载sirna的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰的多肽装载权利要求1所述的抑制ccr2基因表达的sirna制备而成；所述多肽的序列为vqwrirvavirk(seq id no.3)，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段；优选的，所述的多肽vqwrirvavirk碳端酰胺化修饰为vqwrirvavirk-nh2。
4.根据权利要求3所述的装载sirna的纳米粒子，其特征在于所述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg或peg衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为c6-c20中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的装载sirna的纳米粒子，其特征在于所述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的peg衍生物为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-...
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