【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞遗传学。更具体地，涉及一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法。
技术介绍
1、染色体(chromosome)是细胞在有丝分裂或减数分裂时dna存在的特定形式，是基因的载体。染色体在细胞核内其dna紧密卷绕在组蛋白周围并被包装成一个线状结构。当细胞不分裂时，染色体在细胞核中是不可见的；在细胞分裂时，染色体dna变得更紧密，能够在显微镜下观察到。染色体的数目、形态和结构，决定着细胞减数分裂中染色体的配对行为，而正常的配对行为决定了植物孢子的育性。因此，染色体的结构和行为支配着植物的生殖过程和繁育，研究植物染色体对于了解植物的遗传背景具有重要的意义。
2、染色体具有种属特异性，随生物种类、细胞类型及发育阶段不同，其数量、大小和形态存在差异。柑橘属植物的染色体数一般为2n＝18，即共有18条(9对)染色体。由于柑橘类是异花授粉植物，种属间易于杂交，致使种子和母体的遗传基础常常不一样，种子根尖的染色体分析结果不能代表母体，为了更准确了解植株的细胞学特征，有必要对母树本身进行鉴定研究。与其它植物相比，柑橘类果树的染色体制片技术有自己的特殊性，且某些柑橘类果树的染色体都较小，染色体为1.2-3.2μm，减数分裂中期ⅰ的染色体大约为2.0μm，研究起来十分困难。
3、目前柑橘类染色体制片技术对材料的要求较高，常以3-5mm的芽尖茎尖等作为实验材料，材料的获取量少、获取较为困难且较难重复鉴定。而现有技术公开了以柚子的幼叶和花蕾为材料的染色体制片技术(杨晓伶,程舟.柑橘类植物染色体制片新技术[j].同济大学学
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷和不足，提供一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法。
2、本专利技术的目的是提供一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法。
3、本专利技术另一目的是提供快速获得柑橘材料染色体制片方法的应用。
4、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
5、本专利技术提供一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法，包含以下步骤：
6、s1、材料预处理：材料选取柑橘嫩梢叶片，去除叶片主脉后，采用预处理液8-羟基喹啉，进行预处理2.5～3h；
7、s2、固定：去除预处理液，添加固定液进行固定，在4℃条件下固定8-16h；去除固定液，采用ddh2o清洗2～3遍后浸泡10～20min，将固定液置换出来；
8、s3、酶解：加入0.3％～1.5％(w/v)纤维素酶和0.25～1％(w/v)果胶酶的混合酶液，酶解2.5～3h；酶解后混匀、离心、除上清，再加入细胞缓冲液或纯水混匀，室温静置10～40min，再离心、除上清，重复操作一次；最后加入固定液，振荡混匀，得细胞悬液；
9、s4、制片：将细胞悬液滴于玻片上，静置20～30s，滴加相同用量的固定液于玻片上，再次静置20～30s，重复滴加固定液一次，随后将玻片置于酒精灯上烤干，然后晾凉；
10、s5、染色：采用染色液将晾凉后的玻片染色10～40min，染色后清洗，自然晾干后即得柑橘材料染色体玻片。
11、本专利技术基于现有技术制备柑橘类植物染色体玻片的方法(酶解法)，以沙糖橘的嫩叶为材料，通过对不同样本、预处理、酶解条件、固定液配比、不同制片方式等条件进行优化筛选研究，得到一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法，改进并优化了现有技术的制片方法，克服了对染色体较小的沙糖橘等染色体玻片的制备难题；采用本专利技术方法能够获得清晰的染色体图像，在40倍显微镜下就可完成染色体计数工作，简单便捷；并且本专利技术方法制片时间较短，制片效果稳定，还适用于不同柑橘品种材料的染色体制备，解决了柑橘材料制片较为单一的问题。同时，也适用于不同时期及季节的柑橘材料的制备，适用范围广，打破了季节对柑橘染色体制片的限制。
12、优选地，步骤s1材料选取柑橘嫩梢叶片，去除主脉后切成约3～5mm长宽大小，采用0.002m 8-羟基喹啉进行预处理。
13、更优选地，步骤s1选取柑橘嫩梢叶片的上、中部分。
14、进一步优选地，步骤s1中预处理2.5h。
15、优选地，步骤s2中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝3：1的体积比配制的固定液，步骤s3和s4中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝2.5：1的体积比配制的固定液。
16、优选地，步骤s3采用0.6～1.2％(w/v)纤维素酶和0.25～0.5％(w/v)果胶酶的混合酶液。
17、更优选地，步骤s3采用0.6％(w/v)纤维素酶和0.25％(w/v)果胶酶的混合酶液。
18、优选地，步骤s3中在37℃条件下，酶解3h。
19、更优选地，步骤s3中将酶解后的材料混匀、离心、除上清，加入0.075mol·l-1kcl和0.0075mol·l-1na2edta(ph 4.0)的混合液50～500μl，振荡混匀，室温静置10～40min，离心、除上清，重复操作一次；随后加入固定液，振荡混匀，得细胞悬液。
20、优选地，步骤s4中制片方式具体方法为：将细胞悬液置于玻片正上方15-20cm处滴下，静置25s；固定液的滴加方法相同，进行两次滴加。
21、优选地，步骤s5采用体积分数为2％ giemsa染色液染色30min，染完后于染缸中上下抽提清洗两遍，自然晾干后即得柑橘材料染色体片，可上镜观察并计数。
22、更优选地，本专利技术制片后采用40倍镜显微镜观察染色体。
23、本专利技术还提供上述方法在制备不同柑橘品种染色体玻片中的应用。
24、特别地，本专利技术的方法适用于橘、桔、柑、橙、柚等不同品种柑橘材料染色的制备，且基于本专利技术还能够跟进一步优化调整制片条件参数，得到更加好的柑橘染色体玻片用于植物的遗传背景的研究中。
25、优选地，所述柑橘材料为沙糖橘、七月桔、茶枝柑，红江橙或红肉柚。
26、本专利技术具有以下有益效果：
27、本专利技术以沙糖橘嫩叶为材料，通过对现有染色体制片方法条件的优化研究，得到一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法，该方法克本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1选取柑橘嫩梢叶片的上、中部分。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中预处理2.5h。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝3：1的体积比配制的固定液，步骤S3和S4中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝2.5：1的体积比配制的固定液。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3采用0.6～1.2％(W/V)纤维素酶和0.25～0.5％(W/V)果胶酶的混合酶液。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S3采用0.6％(W/V)纤维素酶和0.25％(W/V)果胶酶的混合酶液。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中酶解3h。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中制片方式具体方法为：将细胞悬液置于玻片正上方15-20cm处滴下，静置25s。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1
10.权利要求1～9所述方法在制备不同柑橘品种染色体玻片中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速获得柑橘材料染色体制片的方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1选取柑橘嫩梢叶片的上、中部分。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中预处理2.5h。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s2中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝3：1的体积比配制的固定液，步骤s3和s4中采用的固定液为甲醇：冰乙酸＝2.5：1的体积比配制的固定液。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s3采用0.6～1.2％(w/v)纤维素酶和0.25～0.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志珂，魏鸿瑶，秦永华，胡桂兵，赵杰堂，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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