【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因药物领域，具体地说，涉及一种抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
技术介绍
1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全球第三大常见癌症，具有隐匿性高，进展迅速，恶性程度高等特点。最新的全球癌症统计数据显示，每年全球新发crc病例高达190万例，发病率排名第三，crc死亡率则排名第二，每年有93.5万人死于该病，仅次于肺癌。近年来，crc的发病率和死亡率呈现持续上升的趋势，且年轻人的发病率明显增加。中国肿瘤研究中心公布的最新资料显示，crc已成为我国恶性肿瘤中仅次于肺癌的第二大类型，也是导致全国癌症患者死亡的第四大原因。crc的高发病率和高死亡率仍然是全球健康领域的重大挑战。
2、目前临床上针对crc有多种治疗方法，其中包括内窥镜治疗、手术切除、术前放射治疗、系统治疗、靶向治疗以及免疫治疗等。然而，手术后的高复发和高转移使crc的治愈率和长期生存率未见提高，其死亡率仍然很高。放射治疗(radiation therapy，rt)最早开始于20世纪初，是治疗crc的重要手段之一。高能射线(如x射线或γ射线等)通过破坏癌细胞的dna，抑制癌细胞增殖和转移的方式，达到杀死癌细胞的目的。rt可以用于术前、术后或单独治疗，通常与化疗联合使用，以提高治疗效果。rt分为体内和体外放射，医生将放射线照射到患者身体的特定部位，以杀死或阻止癌细胞的生长和扩散。rt通过破坏癌细胞的dna，减小肿瘤体积，从而方便手术切除。根据统计数据，超过70％的癌症患者在治疗过程中曾接受过
3、蛋白激酶c底物80k-h(protein kinase c substrate 80k-h，prkcsh)，定位于内质网(endoplasmic reticulum，er)中，在那里作为葡萄糖苷酶ii(glucosidase ii，gii)的非催化β亚基发挥作用。在内质网中，它通过与gii-α形成异二聚体gii复合物，参与调节新合成蛋白质的质量以及内质网蛋白的质量控制。prkcsh的内质网易位是gii-α在内质网腔内的表达和保持以及维持gii最佳酶活性所必需的。prkcsh的遗传缺失与常染色体显性遗传性多囊肝病(adpld)有关。prkcsh等位基因的体细胞缺失会导致小鼠和非洲爪蟾模型的胚胎致死。可见prkcsh在细胞中具有重要的生物学作用。在肿瘤相关研究中有报道发现，prkcsh表达增加与乳腺癌淋巴结转移的进展呈正相关。在肺癌患者中prkcsh的表达也受p53活性的影响，当prkcsh基因表达被抑制时，肺癌来源细胞的自噬和凋亡会被进一步促进。prkcsh还与化疗药物—吉非替尼的耐药性相关，在经过吉非替尼治疗非小细胞肺癌后，沉默prkcsh基因能够促进细胞凋亡。prkcsh表达水平的升高能促进乳腺癌淋巴结转移。以上研究均表明prkcsh与肿瘤的发生发展紧密相关。
4、然而抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内外至今无人报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面，提供了一种抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用。
4、所述肿瘤放疗增敏药物是用于结直肠癌的放疗增敏药物。
5、所述抑制或下调prkcsh基因表达的试剂是通过rna干扰(rnai)沉默prkcsh基因的试剂。
6、所述抑制或下调prkcsh基因表达的试剂是靶向prkcsh基因的sirna，包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述反义链的核苷酸序列如seqid no:2所示；
7、正义链：5’-ggaagaagaggcugaagaatt-3’(seq id no:1)
8、反义链：5’-uucuucagccucuucuucctt-3’(seq id no:2)
9、正义链和反义链都在3’端加上了tt以增加sirna的稳定性。
10、所述肿瘤放疗增敏药物抑制了肿瘤细胞辐照后的增殖能力，促进了肿瘤细胞凋亡，增强了辐照对肿瘤细胞的dna损伤程度，提高了肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。
11、本专利技术将nc或prkcsh sirna核苷酸序列通过ribofecttmcp转染试剂转入结直肠癌细胞hct116中，72h应用western blot对结直肠癌细胞hct116的prkcsh蛋白进行检测。结果发现：prkcsh sirna可以有效抑制hct116细胞中高度表达的prkcsh蛋白。
12、进一步，对转染了nc或prkcsh sirna核苷酸序列的hct116-nc细胞和hct116-prkcsh-kd细胞都给于不同剂量(0、2、4和6gy)的60coγ射线照射。随后再培养2周，以评估克隆形成率并研究细胞的生长和增殖情况。研究结果表明，与转染nc序列的hct116细胞相比，转染了prkcsh sirna的hct116细胞在接受大剂量的辐照时，细胞死亡率明显更高。此外，本专利技术还将这两组细胞暴露于8gy的60coγ射线辐照，并继续培养24小时。然后用annexin v-fitc和pi双重染色后，使用流式细胞术评估细胞凋亡。结果表明，与nc转染组相比，prkcshsirna转染的hct116细胞在照射后的凋亡率明显更高。
13、最后，将两组细胞以1×105cells/ml的密度接种到装有2ml dmem培养基的六孔板中。在干净的载玻片上涂上熔融的1％高熔点琼脂糖，然后立即擦拭，制备彗星电泳前涂片。第二天，将两种类型的细胞置于8gy 60coγ辐照下，然后分别在0小时、4小时和8小时内进行胰蛋白酶消化。随后，细胞在1000rpm转速下离心5分钟，用pbs溶液洗涤，弃去上清液。用不含ca2+和mg2+的pbs将得到的单细胞悬浮液调整到2×104cells/ml的浓度。然后，在40℃水浴中将0.4ml悬浮液与1.2ml 0.65％低熔点琼脂糖混合。用移液管将1.2ml细胞悬浮液快速移到预先涂好的载玻片上，并均匀涂抹。干燥后，将载玻片浸入新鲜制备的预冷细胞裂解液中，在4℃黑暗环境中浸泡1小时。裂解后，将载玻片从裂解液中取出，用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用。
2.根据权利要求1所述的抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述肿瘤放疗增敏药物是用于结直肠癌的放疗增敏药物。
3.根据权利要求1所述的抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂是通过RNA干扰沉默PRKCSH基因的试剂。
4.根据权利要求1所述的抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述抑制或下调PRKCSH基因表达的试剂是靶向PRKCSH基因的siRNA，包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，所述肿瘤放疗增敏药物是用于结直肠癌的放疗增敏药物，所述重组载体中包含靶向PRKCSH基因的siRNA，所述靶向PRKCSH基因的siRNA包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸
6.一种肿瘤放疗增敏剂，所述肿瘤指的是结直肠癌，所述肿瘤放疗增敏剂中包含靶向PRKCSH基因的siRNA，所述靶向PRKCSH基因的siRNA包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
...【技术特征摘要】
1.一种抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用。
2.根据权利要求1所述的抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述肿瘤放疗增敏药物是用于结直肠癌的放疗增敏药物。
3.根据权利要求1所述的抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述抑制或下调prkcsh基因表达的试剂是通过rna干扰沉默prkcsh基因的试剂。
4.根据权利要求1所述的抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用，其特征在于，所述抑制或下调prkcsh基因表达的试剂是靶向prkcsh基因的sirna，包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如se...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈辉，杨彦勇，黄瑞雪，刘婷婷，陈媛媛，曹堃，金静，余南希，万志杰，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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