【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体是一种荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold及其应用。
技术介绍
1、苏氨酸(分子量为119.18)最早于1935年首次从血纤维蛋白中分离得到，其结构类似苏糖，故将其命名为苏氨酸，其为无色至微黄色结晶性粉末，有极弱的特异性气味，非常易溶于甲酸，易溶于水，难溶于乙醇和乙醚等有机溶剂。苏氨酸有4种异构体，其中天然存在并具有生理作用的是l-苏氨酸，l-苏氨酸是生物体内所必需的十种氨基酸之一。
2、l-苏氨酸作为一种重要的氨基酸，采用分子生物学方法改造和选育高产l-苏氨酸菌株是提高l-苏氨酸产量的较好方法。为了获得l-苏氨酸高产菌株，目前常采用化学、物理等方式进行无定向随机诱变，或者针对酶的催化活性等理化性质进行定向突变及对于启动子、转录调控等全局性调控元件的定向进化。高通量筛选作为高产l-苏氨酸菌株选育过程中的一个重要环节，将直接影响到l-苏氨酸产量的提升，从而解决l-苏氨酸的需求量问题。
3、利用荧光信号进行高通量筛选是一种重要的筛选方法，将检测到的荧光信号数字化，这些数字可用于分析细胞的荧光特性，例如荧光强度的分布、荧光峰值的位置和形状等特性。通常，可采用荧光染料染色、表达荧光蛋白和添加荧光标记底物等方法使细胞携带荧光信号，其中：常用的荧光染料包括小分子有机染料、量子点、藻胆蛋白和荧光示踪染料(核酸染料、细胞质染料和膜结合染料)等；细胞表达的不外泌荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(bfp)、青色荧光蛋白(cfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)
4、l-苏氨酸生产菌株的高通量筛选依赖于荧光信号。人工构建高通量筛选l-苏氨酸高产菌株的方法，对于基因工程中获得优质的工程菌株、提高l-苏氨酸的产量具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold及其应用，可将该荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold应用于l-苏氨酸生产菌株的筛选中，能够明显提高l-苏氨酸生产菌株的筛选效率。
2、本专利技术技术方案如下：
3、一种荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、优选的，所述荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold的构建方法，包括如下步骤：
5、(1)通过ncbi数据库查找绿色荧光蛋白egfp的编码基因staygold，其核苷酸序列如seq id no.1所示；从大肠杆菌(escherichia coli)的基因组中筛选出基因dct1，并将基因dct1中l-苏氨酸的密码子全部使用稀有密码子act替换，得dct1改造基因，dct1改造基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、(2)通过柔性连接肽将基因staygold与dct1改造基因连接，得荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、其中，所述基因dct1所编码的氨基酸序列中l-苏氨酸占比较高，为16.76％。本专利技术将基因dct1中l-苏氨酸的密码子全部使用稀有密码子act替换，得dct1改造基因；稀有密码子的翻译受相应稀有trna的影响，稀有trna的低丰度显著减慢了l-苏氨酸的表达。将dct1改造基因与基因staygold连接得到荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold后，当环境中l-苏氨酸浓度较高时，稀有密码子识别l-苏氨酸并在氨酰trna合酶的作用下与l-苏氨酸结合，恢复含有稀有密码子的dct1-staygold的表达，dct1-staygold的表达变快，相同时间内，荧光蛋白的表达量更多，荧光强度更高，即可通过荧光强度来确认待筛选菌株生产l-苏氨酸的能力。
8、一种重组质粒，包含所述荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold。
9、优选的，所述重组质粒以pet-22b(+)质粒为表达载体。
10、优选的，所述重组质粒的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、所述荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold或所述重组质粒在筛选l-苏氨酸生产菌株中的应用。
12、一种筛选l-苏氨酸生产菌株的方法，是将所述重组质粒导入到待筛选菌株中，得重组菌株；将重组菌株接种至培养基中进行培养，得培养液，根据培养液的荧光强度即可确认待筛选菌株生产l-苏氨酸的能力。
13、优选的，可结合高效液相色谱法对筛选出的荧光强度较高的l-苏氨酸生产菌株进行验证。
14、有益效果：本专利技术提供了一种荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold，将含有该荧光蛋白筛选标记基因的重组质粒导入到待筛选菌株中，然后根据待筛选菌株发酵液的荧光强度即可快速筛选出l-苏氨酸高产菌株，大大提高了l-苏氨酸生产菌株的筛选效率。
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1.一种荧光蛋白筛选标记基因DCT1-staygold，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因DCT1-staygold的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的荧光蛋白筛选标记基因DCT1-staygold。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，以pET-22b(+)质粒为表达载体。
5.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因DCT1-staygold或权利要求3所述重组质粒在筛选L-苏氨酸生产菌株中的应用。
7.一种筛选L-苏氨酸生产菌株的方法，其特征在于，是将权利要求3所述重组质粒导入到待筛选菌株中，得重组菌株；将重组菌株接种至培养基中进行培养，得培养液，根据培养液的荧光强度即可确认待筛选菌株生产L-苏氨酸的能力。
【技术特征摘要】
1.一种荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的荧光蛋白筛选标记基因dct1-staygold。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，以pet-22b(+)质粒为表达载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨露，汪俊卿，李楠，刘月涵，吴静雯，杜博文，王瑞明，李丕武，王婷，苏静，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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