【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，特别涉及一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法及其应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicle，evs)是一种直径从40nm到1000nm不等的异质性膜封闭囊泡。无论在正常生理或病理状态下，几乎所有类型的活细胞都会主动脱落evs，并大量存在于所有的体液中。evs携带多种成分，例如蛋白质、脂质、rna和dna等，通过从亲代细胞转移这些生物活性分子到受体细胞，evs成为细胞间通讯的重要媒介。然而，evs的高度异质性阻碍了对其生物发生、分子组成、生物分布和功能的了解。解决evs的异质性问题对于阐明其机理以及设计诊断和治疗工具至关重要。目前多数研究都关注在evs相关蛋白质和evs-rna的检测分析上，但对evs中的dna货物的研究较少。
2、evs携带了不同类型的dna，包括染色体dna和线粒体dna。多个研究已经证实了evs相关dna既附着在evs的膜表面，也被包裹在evs的管腔中。ev-dna在维持细胞稳态、调节免疫反应和肿瘤发展中发挥着至关重要的作用。肿瘤来源的evs携带的dna片段覆盖了亲本肿瘤细胞的所有染色体，同时还反映了它们的基因突变状态(例如原癌基因c-myc的扩增与肿瘤基因突变(braf、p53、kras及egfr等))。此外，最近的研究表明，不同数量和类型的evs-dna被选择性地包装到evs中。肿瘤细胞来源的evs(tevs)中提取的ev-dna的丰度显著高于从正常细胞释放的evs(nevs)中提取的ev-dna。同时，从肿瘤患者的血浆中分离的ev-
3、为了在单个ev层面深入表征ev-dna的生物物理特性，本申请提供了一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法及其应用。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中无法在单个ev层面深入表征ev-dna的生物物理特性的缺陷及不足，本申请提供一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法及其应用。本申请提供的单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法，通过将含有细胞外囊泡的水相溶液注入尖端玻璃毛细管、尖端玻璃毛细管在振动下在其管口形成水相液滴，水相液滴滴入盛有油相的容器后，形成油包水液滴，油包水液滴凝胶化后，形成单个细胞外囊泡水凝胶液滴；对单个细胞外囊泡水凝胶液滴处理后，可以精确分析单个细胞外囊泡中的dna货物，实现在单个细胞外囊泡层面深入表征ev-dna的生物物理特性。
2、本申请的一实施例，提供一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法，包括以下步骤：
3、将含有细胞外囊泡的水相溶液注入尖端毛细管，所述尖端毛细管在振动下在其管口形成水相液滴；
4、所述水相液滴滴入盛有油相的容器中，形成油包水液滴；
5、所述油包水液滴凝胶化，形成单个细胞外囊泡水凝胶液滴；
6、其中，水相溶液包括四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和双巯基聚乙二醇，油相包括有机硅类乳化剂和矿物油；
7、所述水相溶液中含有细胞外囊泡的个数和所述水相溶液的体积与所述水相液滴的体积的比值相等。
8、作为一种实施方式，所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴的直径介于20μm～40μm。
9、作为一种实施方式，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯与所述双巯基聚乙二醇的摩尔比为1：(1～4)。
10、作为一种实施方式，所述水相溶液中，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和所述双巯基聚乙二醇的含量介于3％(w/v)～10％(w/v)。
11、作为一种实施方式，所述有机硅类乳化剂为gransurf 90。
12、作为一种实施方式，所述细胞外囊泡在加入水相溶液之前包括纯化的步骤，所述纯化的方式选自超速离心、超滤和尺寸排阻色谱法中的一种或几种。
13、作为一种实施方式，所述振动条件为：工作频率为90khz～110khz，输入电压为15v～25v，调幅频率为2hz至1000hz。
14、作为一种实施方式，所述细胞外囊泡来源于人体组织细胞。
15、根据本申请的另一实施例，提供一种根据本申请的制备方法在制备单个dna水凝胶液滴中的应用或者根据本申请的制备方法制备的单个细胞外囊泡水凝胶液滴在分析单个细胞外囊泡的dna中的应用。
16、作为一种实施方式，分析单个细胞外囊泡的dna包括将单个细胞外囊泡水凝胶液滴转移到微流控芯片中，并将所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴固定于微流控芯片的单层通道内，后在微流控芯片中盖上玻璃片；清洗掉所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴周围的油相。
17、作为一种实施方式，清洗掉所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴周围的油相后，还包括对单个细胞外囊泡水凝胶液滴进行裂解和dna扩增的步骤；或者，包括对单个细胞外囊泡水凝胶液滴进行酶消化单个细胞外囊泡外的dna、再进行裂解和dna扩增的步骤；或者，包括对单个细胞外囊泡水凝胶液滴进行dna扩增的步骤。
18、作为一种实施方式，分别用异丙醇和水清洗掉所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴周围的油相。
19、如上所述，本申请的单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法及其应用，具有以下有益效果：
20、本申请提供的制备方法制备的单个细胞外囊泡水凝胶液滴将单个细胞外囊泡包封在单分散液滴中，降低了样本交叉的风险，并能通过终点分析检测和绝对定量含dna的细胞外囊泡；本申请使用的水相溶液聚合后形成可水解降解的peg水凝胶网络，能够产生热稳定、可回收、独立分区的单个细胞外囊泡水凝胶液滴，产生的单个细胞外囊泡水凝胶液滴可以发生数千次独立的扩增事件。
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1.一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴的直径介于20μm～40μm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯与所述双巯基聚乙二醇的摩尔比为1：(1～4)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水相溶液中，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和所述双巯基聚乙二醇的含量介于3％(w/v)～10％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机硅类乳化剂为Gransurf 90。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡在加入水相溶液之前包括纯化的步骤，所述纯化的方式选自超速离心、超滤和尺寸排阻色谱法中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述振动条件为：工作频率为90kHz～
8.一种如权利要求1～7任一项所述的制备方法在制备单个DNA水凝胶液滴中的应用或者根据权利要求1～7任一项所述的制备
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，分析单个细胞外囊泡的DNA包括将单个细胞外囊泡水凝胶液滴转移到微流控芯片中，并将所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴固定于微流控芯片的单层通道内，后在微流控芯片中盖上玻璃片；清洗掉所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴周围的油相的步骤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，清洗掉所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴周围的油相后，还包括对单个细胞外囊泡水凝胶液滴进行裂解和DNA扩增的步骤；或者，
...【技术特征摘要】
1.一种单个细胞外囊泡水凝胶液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单个细胞外囊泡水凝胶液滴的直径介于20μm～40μm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯与所述双巯基聚乙二醇的摩尔比为1：(1～4)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水相溶液中，所述四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和所述双巯基聚乙二醇的含量介于3％(w/v)～10％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机硅类乳化剂为gransurf 90。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡在加入水相溶液之前包括纯化的步骤，所述纯化的方式选自超速离心、超滤和尺寸排阻色谱法中的一...
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