【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白和人乳头瘤病毒18型抗体的elisa检测试剂盒。
技术介绍
1、人乳头瘤病毒(hpv)是一种很小的无包膜dna病毒，包含一个双链dna基因组。hpv病毒高风险类型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型，16和18型是两种最常见的高危基因型。研究表明，在全球范围内，可以在大约70％的宫颈癌患者中检测到16型和18型两种型别。hpv 16型主要引起子宫颈鳞癌，hpv 18型主要与子宫颈腺癌相关，在子宫颈腺癌中hpv 18的感染率高达30.6％。
2、hpv基因组编码八个开放阅读框(orf)，根据功能不同，基因组可分为3个区，即早期蛋白编码区(er),其主要编码的蛋白为e1，e2，e4，e5，e6，e7；晚期蛋白编码区(lr),其编码的蛋白为l1和l2；长末端控制区(lcr)。其中e6和e7被认为是hpv最主要的致病基因，e6在hpv的致病过程中更是起着关键的作用。当hpv感染宿主后，病毒癌蛋白e6与机体的p53(一种抑癌基因)结合并使p53失去正常功能，引发宿主细胞启动dna修复、细胞凋亡或生长停滞，最终导致细胞的异常发育，因此e6蛋白可被选择作为hpv相关肿瘤治疗性疫苗的靶抗原。但是e6基因属于癌基因，直接用作抗原基因构建治疗性疫苗，存在较大程度的安全性隐患。需要通过对癌基因e6关键位点进行突变，降低甚至消除e6基因的致癌性，从而提高e6蛋白作为治疗性疫苗靶抗原的安全性。
3、目前国内外已有多种hpv预防
技术实现思路
1、为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白及其应用，通过对hpv18型e6蛋白的进行氨基酸突变(a63l，h120y，s140d)以及密码子的优化，利用大肠杆菌发酵系统表达目的蛋白，提高了目的蛋白的溶解性和稳定性，从而显著提高了hpv18型e6蛋白的制备效率，获得了具有高纯度、保持天然活性的hpv18型e6蛋白。该方法操作简单，成本低廉。采用该方法制备得到的hpv18型e6蛋白可作为包被抗原，用于评价靶向hpv18型e6的疫苗的体液免疫效力。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白，所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种编码所述人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、在本专利技术的第三方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。所述载体可以是常规的载体；具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体。
7、在本专利技术的第四方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。
8、在本专利技术的第五方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的制备方法，所述方法包括：
9、获得人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体；
10、将所述人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞，获得表达工程菌；
11、将所述表达工程菌进行诱导表达及纯化，获得人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白。
12、在本专利技术的第六方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型抗体的elisa检测试剂盒，所述elisa检测试剂盒包括：包被有所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的elisa酶标板。
13、进一步地，所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的包被量为2-6μg/孔。优选地，所述的人乳头瘤病毒18型突变型e7蛋白的包被量为4μg/孔。
14、进一步地，所述elisa检测试剂盒还包括：
15、辣根过氧化物酶标记的酶标二抗；
16、标准阴性血清；
17、标准阳性血清；
18、检测试剂：包被液、包被用洗液、稀释液、洗涤液、封闭液、抗体稀释液、显色液和终止液。
19、上述技术方案中，所述阴性对照血清来源于spf小鼠，阳性血清为spf小鼠免疫靶向人乳头瘤病毒18型e6疫苗后采集的血清；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠igg。
20、在本专利技术的第七方面，提供了一种采用所述人乳头瘤病毒18型抗体的elisa检测试剂盒的使用方法，所述方法包括：
21、将所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白稀释后加到酶标板中吸附4℃过夜，空干后封闭，获得包被有人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的elisa酶标板；
22、将待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗加至所述包被有人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的elisa酶标板的板孔中进行孵育；弃液体然后洗涤并甩干，后加入辣根过氧化物酶标记的酶标二抗进行孵育，洗涤后甩干；
23、加入显色液室温避光孵育，后加入终止液终止反应，在酶标仪上450nm波长下测定od值。
24、本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
25、1、本专利技术提供的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白，与野生型hpv 18e6蛋白相比去除了第1位甲硫氨酸，并且在以下2个位置改变了氨基酸f49r、155-158del以降低e6蛋白的致癌性。此外，我们突变了三个氨基酸(a63l、h120y、s140d)，使蛋白更稳定更有利于表达(如表4)，即通过对hpv18型e6蛋白的氨基酸优化提高了表达量和纯度；
26、编码e6蛋白的序列进一步经过大肠杆菌密码子偏好性优化，e6的核酸序列如seqid no：2所示；使e6蛋白能够通过大肠杆菌表达系统实现可溶性表达，且融合蛋白可以通过金属亲和层析纯化得到纯度和活性较高的重组蛋白；
27、本专利技术的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白，抗原特异性良好，亲和力强，可用于检测人乳头瘤病毒18型e6抗体。
28、2、本专利技术提供的人乳头瘤病毒18型e6抗体的elisa检测试剂盒，可用于人乳头瘤病本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
5.一种人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的表达工程菌，其特征在于，所述工程菌包含权利要求3所述的人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的表达载体。
6.一种人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
7.一种人乳头瘤病毒18型的E6抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括：包被有权利要求1所述的人乳头瘤病毒18型突变型E6蛋白的ELISA酶标板。
8.根据权利要求
9.根据权利要求7所述的一种人乳头瘤病毒18型E6抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒还包括：
10.一种权利要求7所述人乳头瘤病毒18型E6抗体的ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
5.一种人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达工程菌，其特征在于，所述工程菌包含权利要求3所述的人乳头瘤病毒18型突变型e6蛋白的表达载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，杨屹，陈达，吴瑜，邓吴娴，张彦申，沈燕琼，何天翼，张苗苗，
申请(专利权)人：合肥阿法纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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