【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种野生型rsv f蛋白的突变体及其应用。
技术介绍
1、rsv是一种负链单链rna病毒，属于pneumovirinae属和paramyxoviridae科。成年人感染rsv时通常表现为鼻窦感染或普通感冒的症状，老年人rsv感染可能进展为支气管炎或肺炎。儿童的症状通常更为严重，包括支气管炎和肺炎等。中国疾病预防控制中心在2009年至2019年期间对急性呼吸道感染的所有年龄段患者进行了全国性前瞻性监测。在这项研究中，流感病毒、呼吸道合胞病毒和人类鼻病毒是三种主要的病毒病原体，其比例分别为28.5％、16.8％和16.7％。
2、rsv基因组大小约15～16kb，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白和3种非结构蛋白(ns1、ns2和m2-2)，结构蛋白包括3种跨膜表面蛋白(g、f、sh)、2种基质蛋白(m和m2-1)、3种核壳蛋白(l、n和p)。病毒表面的粘附蛋白(attachment protein,g)g蛋白介导病毒与宿主细胞的结合，融合蛋白(fusion protein,f)f蛋白介导病毒与宿主细胞膜的融合，使病毒进入细胞内，二者对于病毒复制至关重要，且均含有b细胞和t细胞表位，是刺激机体产生体液和细胞免疫最重要的病毒抗原蛋白。f蛋白编码区高度保守，a亚型和b亚型的f蛋白氨基酸序列至少有90％相同，故f蛋白诱导的中和抗体可以同时抑制a、b亚型rsv感染。
3、几十年来，免疫学家们对于rsv疫苗的开发多数以失败告终。究其原因，可能是因为rsv病毒结构的特殊性，f蛋白和g蛋白因在病毒入侵
4、f蛋白结构呈动态变化，首先在宿主细胞中被转录翻译为单个无活性多肽(f0)；接着经宿主细胞弗林蛋白酶(furin protease)第1次切割，生成部分切割的融合前祖蛋白(prefusogenic protein)；随后发生第2次弗林蛋白酶切割，生成f2和f1亚基，2个亚基以2个二硫共价键连接为一个单体，然后3个单体形成亚稳态的功能性融合前f蛋白(prefusionprotein，pref)三聚体；此后无须进一步处理即可进行构象重排形成热力学稳定的融合后f蛋白(postfusion protein，postf)(science，2013，340：1113□1117)。
5、在对成年人血清详细的研究中发现，血清中大多数rsv中和抗体主要是与pre型f蛋白的表位φ、v特异性结合的抗体。因而具有特异性抗原表位的融合前f蛋白是最理想的rsv疫苗抗原。但融合前f蛋白不够稳定，对其氨基酸序列进行改造从而提高稳定性但又不影响重要的抗原表位，是rsv疫苗研发中的难点之一。
6、国际上多款候选疫苗因安全性问题或不理想的效力而已失败告终，2023年葛兰素史克与辉瑞的针对f蛋白的亚单位疫苗批准上市。辉瑞的rsv疫苗(abrysvo)是一种双价疫苗，它含有等量的分别来自rsv a与b病毒亚型的重组pref蛋白，葛兰素史克的疫苗(arexvy)包含重组的pref抗原(rsvpref3)和佐剂as01。而rsv的mrna疫苗还未有上市的品种，它的安全性和有效性还有待临床试验的开展。
7、因此，对f蛋白的氨基酸序列进行优化，使编码该突变体的mrna疫苗能在体内表达更稳定的pref蛋白，对于诱导机体产生更强的中和抗体从而增强对rsv病毒的保护效力具有重要临床转化意义。
技术实现思路
1、为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种野生型rsv f蛋白的突变体及其应用，制备编码rsv病毒融合前f蛋白的mrna疫苗，使其在体内能表达更稳定的pref蛋白从而诱导机体产生更强的中和抗体，从而增强对rsv病毒的保护效力。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种野生型rsv f蛋白的突变体，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比存在以下3个突变位点：q283e、t324c、g438c，其中t324c和g438c增加了分子内的二硫键对，q283e与359位的赖氨酸k形成分子内静电相互作用，氨基酸序列如seq idno.1所示。
4、进一步地，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比，除存在所述的3个突变位点外，还存在以下3个突变位点：e82y、v179l、v360l，可以增加蛋白分子内部和分子间的疏水性，氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、在本专利技术的第二方面，提供了一种野生型rsv f蛋白的突变体，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比，存在以下3个突变位点：e82y、v179l、v360l，氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种编码所述野生型rsv f蛋白的突变体的核酸分子。
7、在本专利技术的第四方面，提供了一种表达所述野生型rsv f蛋白突变体的表达载体。
8、所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。所述载体可以是常规的载体；具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或mrna。
9、在本专利技术的第五方面，提供了一种野生型rsv f蛋白的突变体的宿主细胞，所述宿主细胞可表达所述的核酸分子。
10、在本专利技术的第六方面，提供了一种医药组合物，包括所述的野生型rsv f蛋白的突变体或者所述的核酸分子。
11、在本专利技术的第七方面，提供了一种rsv的疫苗，所述疫苗包括所述的野生型rsv f蛋白的突变体或者所述的核酸分子。
12、进一步地，所述疫苗还包括药学上接受的佐剂。
13、本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
14、本专利技术提供的野生型rsv f蛋白的突变体及其应用，通过对表达rsv f蛋白dna序列的改造，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比存在以下3个突变位点：q283e、t324c、g438c，其中t324c和g438c之间增加了分子内的二硫键对，q283e与赖氨酸(k359)形成分子内静电互作，氨基酸序列如seq id no.1所示，经过上述改造后的mrna在细胞中表达的蛋白比天然序列的pref蛋白更稳定、能够诱导更高效的中和抗体产生，从而增强抗病毒效力。进一步地，本专利技术在上述3个突变位点：q283e、t324c、g438c的基础上，增加3个突变位点：e82y、v179l、v360l，稳定性和产生的抗体效价进一步提高，从而增强抗病毒效力。
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1.一种野生型RSV F蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比存在以下3个突变位点：Q283E、T324C、G438C，其中T324C和G438C之间增加了二硫键，Q283E与359位的赖氨酸K形成分子内静电互作，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种野生型RSV F蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比，存在权利要求1所述的3个突变位点外，还存在以下3个突变位点：E82Y、V179L、V360L，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种野生型RSV F蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比，存在以下3个突变位点：E82Y、V179L、V360L，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种编码权利要求1-3任一所述的野生型RSV F蛋白的突变体的核酸分子。
5.一种表达权利要求1-3任一所述的野生型RSV F蛋白的突变体的表达载体。
6.一种野生型RSV F蛋白突变体的表达工程菌，其特征在于，所述工程
7.一种表达野生型RSV F蛋白突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的核酸分子。
8.一种医药组合物，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的野生型RSV F蛋白的突变体或者权利要求4所述的核酸分子。
9.一种RSV的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1-3任一所述的野生型RSV F蛋白的突变体或者权利要求4所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的一种RSV的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上接受的佐剂。
...【技术特征摘要】
1.一种野生型rsv f蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比存在以下3个突变位点：q283e、t324c、g438c，其中t324c和g438c之间增加了二硫键，q283e与359位的赖氨酸k形成分子内静电互作，氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种野生型rsv f蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比，存在权利要求1所述的3个突变位点外，还存在以下3个突变位点：e82y、v179l、v360l，氨基酸序列如seq id no.3所示。
3.一种野生型rsv f蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型rsv f蛋白相比，存在以下3个突变位点：e82y、v179l、v360l，氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.一种编码权利要求1-3任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨屹，陈达，李敏，吴瑜，张彦申，张家晨，沈艳琼，张苗苗，
申请(专利权)人：合肥阿法纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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