【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑技术进行农作物育种，尤其是一种通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法及其应用。
技术介绍
1、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,cgmmv)是一种正单链rna病毒，形状为直杆状，属烟草花叶病毒属(tobamovirus)，于1935年第一次在英国报道(ainsworth,g.c.mosaic diseases of the cucumber.annals of applied biology,1935,22(1):55-67。主要侵染葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、瓠瓜等，还会侵染本氏烟和普通烟等，不同株系的cgmmv在不同寄主植物上表现的症状不同，cgmmv可引起本氏烟花叶斑驳、叶片突起、植株矮化等症状。cgmmv的适应性和抗逆性极强，常温下可以存活数月，低温条件下可以存活数年，在土壤里能至少保持十个月的侵染力(varveri,c.,vassilakos,n.,&bem,f.characterization and detection of cucumber green mottlemosaic virus in greece.phytoparasitica,2002,30(5):493-501)。其传播途径一般为种子传播、土壤传播、接触摩擦传播、人工嫁接、授粉、农事操作等，也有报道称烟蚜可能传播黄瓜绿斑驳花叶病毒(洪璠璠,刘大成,杨柳,杨中侠.烟蚜传播黄瓜绿斑驳花叶病毒的可能性及方式.中国农学通报,2018,34(26
2、前期的研究通过遗传分析，明确cgmmv抗病性为一个以上隐性抗病基因控制，隐性抗病基因在育种利用时会增加育种的工作量，育种周期更长；且在多代回交育种时，由于不同亲本的遗传背景的影响，易使新种质的园艺性状发生变化影响了品种的特性。基因编辑技术的发展，为基因在育种中的利用提供了有力的支撑。
3、目前尚无利用基因编辑技术创制抗cgmmv新种质的相关研究。
技术实现思路
1、本专利技术针对本氏烟中现有抗cgmmv材料抗原不足，抗病材料在生产上发生丧失抗性的问题，以及常规育种时间长，成本高的问题，通过基因编辑手段对wprb基因进行基因编辑，快速赋予感病材料对cgmmv的抗性，同时保持原感病材料的园艺性状不变。本专利技术将为研究cgmmv的致病/抗病机制提供重要的种质资源，为改良抗病性品种提供重要的参考依据。
2、为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案得以解决：
3、一种通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病本氏烟新种质的方法，通过对wprb外显子区域进行基因编辑，利用植物自身对dbs的修复机制，引入dna序列的缺失，使wprb基因功能丧失，从而获得对cgmmv的抗病性。
4、进一步地，利用crspr/cas9技术对wprb进行基因编辑。
5、进一步地，包括以下步骤：
6、(1)sgrna靶位点选择在wprb基因的外显子区域，根据crispr/cas9靶位点设计原则，选取原型间隔序列毗邻继续上游20bp碱基作为靶位点，靶位点还应具备gc含量为40-60％，中靶率高、脱靶率低等特点。将靶位点第一个碱基强行改为g将提高编辑效率，即5’-gn19-ngg-3’，ngg为pam序列，n19表示除g之外的19bp碱基的识别序列；
7、(2)根据识别序列设计oligo序列引物对，包括引物对1和/或引物对2；引物对1的核苷酸序列为：
8、g1-sense:5’-ttg-gataatcaggacacagctga-3’
9、g1-anti:5’-aac-tcagctgtgtcctgattatc-3’
10、引物对2的核苷酸序列为：
11、g2-sense:5’-ttg-gggatttgacaagggagc-3’
12、g2-anti:5’-aac-gctcccttgtcaaatccc-3’
13、将引物浓度稀释至10μm，取上述引物各5μl，混匀；95℃放置3分钟，室温冷却至25℃，16℃5分钟，完成oilgo二聚体的合成；
14、(3)根据crispr./cas9试剂盒vk005-14(北京唯尚立德生物科技有限公司)的载体构建说明书，吸取1μl已合成的oligo二聚体、1μl cas9/grnavector、2μl solution1、2μlsolution2以及6μl h20于0.2ml离心管中，混合均匀，16℃反应2h；
15、将连接成功的载体转入大肠杆菌感受态中，置于37℃静置摇床中过夜；挑取单克隆进行质粒抽提及测序，测序引物序列为：5’-gatgaagtggacggaaggaaggag-3’将测序结果为阳性的质粒利用热击法转入农杆菌gv3101中；
16、(4)以一个月大的本氏烟叶片为外植体，通过叶盘法进行植株再生，通过农杆菌介导进行遗传转化，经潮霉素抗性筛选，获得本氏烟再生苗。
17、进一步地，所述步骤(3)中还包括：将两个靶点构入同一个载体。
18、进一步地，还包括：
19、再生植株基因编辑检测步骤：根据靶位点上下游序列，设计可以扩增靶位点的引物，提取再生植株dna，将其作为模板进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，对再生植株是否发生基因编辑，以及编辑类型是否为纯合突变进行序列分析；
20、和或抗性鉴定步骤：将检测到发生基因编辑的本氏烟t0代植株进行自交得到t1代植株，t1代植株自交得到t2代植株，对t2代植株中的纯合突变株系进行cgmmv接种鉴定。通过表型、病状出现时间统计、利用qpcr及western blot技术对cgmmv cp含量进行分析来鉴定突变体的抗病性。
21、所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病本氏烟新种质的方法在烟草育种中的应用。
22、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
23、(1)本专利技术提供了一种通过基因编辑手段创制本氏烟抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病新种质的方法，通过对wprb基因外显子区域进行基因编辑，t0代多代自交得到纯合编辑植株，即为抗cgmmv本氏烟新种质；
24、(2)本专利技术的方法较常规育种可以更快的赋予感病材料cgmmv的抗性；本专利技术的方法较常规育种可以更好的保留受体材料的农艺性状；
25、(3)通过本专利技术创制的抗性新种质是对现有cgmmv抗病材料的有力补充；
26、(4)本专利技术具有广阔的应用前景和经济效益。
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1.一种通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，通过对本氏烟WPRb外显子区域进行基因编辑，利用植物自身对DBS的修复机制，引入DNA序列的缺失，使WPRb基因功能丧失，从而获得对CGMMV的抗病性。
2.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，利用CRSPR/Cas9技术对WPRb进行基因编辑。
3.根据权利要求2所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括：将两个靶点构入同一个载体。
5.根据权利要求3所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，还包括：
6.权利要求1-4任一所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法在烟草育种中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，通过对本氏烟wprb外显子区域进行基因编辑，利用植物自身对dbs的修复机制，引入dna序列的缺失，使wprb基因功能丧失，从而获得对cgmmv的抗病性。
2.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病植物新种质的方法，其特征在于，利用crspr/cas9技术对wprb进行基因编辑。
3.根据权利要求2所述的通过基因编辑创制抗黄瓜...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨景华，李英杰，蔡玲敏，张明方，胡仲远，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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