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【技术实现步骤摘要】
本申请涉及核酸检测,具体涉及一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法。
技术介绍
1、包载核酸的lnp制剂在使用过程中需要确认药物有效包载浓度。因此准确地测定lnp制剂实际包载药物浓度与包封率较为重要。
2、通常,包载核酸的lnp制剂中核酸含量的测定方法:先检测未破乳前溶液中游离的核酸浓度clnp中游离的核酸,再通过加入一定浓度的triton-100进行破乳,使lnp制剂内部的核酸全部释放,并对溶液中的核酸总量进行测定得到clnp-rna全部核酸,最后通过公式计算包封率(如公式1所示)从而准确地测定了lnp制剂内部包载的核酸浓度及其包封率。例如,使用ribogreen测定mrna-lnp的包封率和其mrna浓度。
3、
4、随着永久性阳离子脂质或化合物在lnp核酸制剂中的广泛应用,专利技术人在使用triton-100破乳检测其全部核酸浓度时,出现破乳不充分进而导致检测浓度与理论值相差较大的问题。
5、因此,期望提供一种可充分裂解含永久性阳离子脂质的lnp核酸制剂,用以准确地定量测定其有效核酸浓度及包封率。
6、现有技术文献
7、非专利文献1pharmaceutics 2022,14,2086
8、专利文献2wo 2022/204286 al
技术实现思路
1、非专利文献1公开使用1%(v/v)triton-100裂解含有dotap包载sirna的lnp,同时使用ribogreen试剂盒检测其包
2、专利文献2中公开使用triton-100并使用ribogreen试剂盒检测含有阳离子脂质(sort lipid)包载核酸的lnp的包封率,其中核酸包括mrna、sgrna、cas9 mrna。对于sirna的包载率检测以及定量检测,专利文献1中未见公开或详细的描述。
3、现有研究中对于含有阳离子脂质包载sirna的lnp的包封率通常使用triton-100进行破乳,并使用ribogreen试剂盒进行包封率的检测,而在该方法下,对于lnp包载的sirna定量检测未有公开明确的说明。
4、本专利技术通过使用十二烷基硫酸钠(以下,有时称为“sds”)对包载有核酸的lnp进行破乳,并用本领域用于核酸含量检测的方法、试剂盒等进行核酸含量的定量检测以及包封率检测,例如microrna试剂盒。
5、本申请的第一方面提供一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂。
6、在一个优选的实施方式中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物包含永久性阳离子脂质,所述永久性阳离子脂质的pka为9以上,优选地,所述永久性阳离子脂质的pka为14以上。
7、所述永久性阳离子脂质包含选自磷脂、糖类、蛋白、氨基酸、维生素和sort脂质中的一种以上。
8、在一个优选的实施方式中,所述永久性阳离子脂质为选自n,n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、n-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)中的一种以上。
9、在一个优选的实施方式中,所述核酸碱基对数量为1000以下,优选地,所述核酸碱基对数量为500以下。
10、优选地,所述核酸选自sirna、mrna、trna、rrna、cdna、mirna、核酶、反义寡核苷酸、质粒dna、肽核酸、三链形成型寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide,tfo)、基因中的一种以上,更优选地,所述的核酸为sirna。
11、在一个优选的实施方式中,所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.20wt%-3wt%,优选为0.25wt%-2.5wt%,更优选0.25%-1wt%。
12、在一个优选的实施方式中,所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.25wt%、0.3wt%、0.35wt%、0.4wt%、0.45wt%、0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1wt%、1.5wt%、2wt%或2.5wt%。在一个优选的实施方式中,利用十二烷基硫酸钠进行破乳的时间范围是10分钟至12小时,进一步可以为15分钟至12小时。
13、优选地,所述破乳的时间是10分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时或12小时。
14、在一个优选的实施方式中,利用十二烷基硫酸钠进行破乳的温度是25±2℃至37±2℃,优选地,所述破乳的温度是30±2℃至37±2℃,优选地,所述破乳的温度是25±2℃、26±2℃、27±2℃、28±2℃、29±2℃、30±2℃、31±2℃、32±2℃、33±2℃、34±2℃、35±2℃、36±2℃、37±2℃。
15、在一个优选的实施方式中,核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法包括以下步骤:
16、s1:检测核酸脂质纳米颗粒复合物中游离核酸浓度;
17、s2:使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂,对核酸脂质纳米颗粒复合物进行破乳;
18、s3:检测总核酸浓度。
19、进一步地,所述方法还包括:
20、s4:根据游离核酸浓度和总核酸浓度,计算包封率。
21、在一个实施方式中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物是通过以下方法制备得到的:按配方量混合脂质,再与荷载混合,即得。
22、在一个优选的实施方式中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物是通过以下方法制备得到的,所述方法包括以下步骤:
23、s1:将可电离阳离子脂质、永久性阳离子脂质、结构脂质、聚合物共轭脂质溶于有机溶剂中,制得到脂质溶液,任选地,此步骤中还包括将辅助脂质溶于有机溶剂中;
24、s2:将核酸溶于缓冲液中,制得核酸原液;
25、s3:将脂质溶液和核酸原液充分混匀后得到混合液,替换混合液中的有机溶剂为溶媒缓冲液后制得核酸脂质纳米颗粒复合物。
26、在一个实施方式中,所述溶媒缓冲溶液为磷酸盐缓冲液,进一步可以为杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)。
27、在一个优选的实施方式中,使用microrna检测试剂盒对核酸脂质纳米颗粒复合物中的核酸进行定量检测。
28、在一个优选的实施方式中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物包括但不限于核酸、可电离阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质、永久性阳离子脂质和聚合物共轭脂质;其配方和制备方法本领域技术人员可根据现有技术获得。
29、为了更清晰的描述本申请的技术方案,我们提供一种核酸脂质纳米颗粒复合物,其包含:
30、(a)核酸;
31、(b)可电离阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的10mol%-80m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂。
2.根据权利要求1所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物包含永久性阳离子脂质,所述永久性阳离子脂质带正电荷或pKa为9以上。
3.根据权利要求2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述永久性阳离子脂质包含选自磷脂、胆固醇类阳离子脂质、糖类、蛋白、氨基酸、维生素和SORT脂质中的一种以上。
4.根据权利要求2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述永久性阳离子脂质为选自N,N-二羟乙基甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(BHEM-Chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)中的一种以上。
5.根据权利要求1或2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述核酸碱基对数量为1000以下,优选为500以下。
6.根据权利要求5所述的核酸
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.20wt%-3wt%,优选为0.25wt%-2.5wt%,更优选为0.25wt%-1wt%。
8.根据权利要求7所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.25wt%、0.3wt%、0.35wt%、0.4wt%、0.45wt%、0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1wt%、1.5wt%、2wt%或2.5wt%。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,利用十二烷基硫酸钠进行破乳的时间范围是10分钟至12小时;
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其包括以下步骤:
...【技术特征摘要】
1.一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂。
2.根据权利要求1所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述核酸脂质纳米颗粒复合物包含永久性阳离子脂质,所述永久性阳离子脂质带正电荷或pka为9以上。
3.根据权利要求2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述永久性阳离子脂质包含选自磷脂、胆固醇类阳离子脂质、糖类、蛋白、氨基酸、维生素和sort脂质中的一种以上。
4.根据权利要求2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述永久性阳离子脂质为选自n,n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、n-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)中的一种以上。
5.根据权利要求1或2所述的核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法,其中,所述核酸碱基对数量为1000以下,优选为500以下。
6.根据权利要求5所述的核酸脂质...
【专利技术属性】
技术研发人员:雷佳霓,孙卓睿,王雪,杨柳,刘安东,
申请(专利权)人:北京剂泰医药科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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