【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化检测，涉及雌二醇的生物素偶联结构及其合成方法与应用。
技术介绍
1、雌二醇(estradiol，e2)是卵巢分泌的类固醇激素，是主要的雌性激素，化学式为c18h24o2，摩尔质量272.38g/mol。负责调节女性特征、附属性器官的成熟和月经-排卵周期，促进乳腺导管系统的产生。雌二醇等雌激素的血清浓度在月经周期中周期变化，除去卵泡期早期，生育年龄女性雌二醇的血清浓度略高于雌酮，为浓度水平最高的雌激素。怀孕期间血清浓度高的是雌三醇，更年期是雌酮。三种激素在体内可相互转化，其它两者可看做雌二醇的代谢产物。雌二醇在男性体内作为睾酮的代谢产物同样存在，其血清浓度(<35pg/ml)相当于绝经后的妇女。雌二醇与雌酮可相互转化。雌二醇不仅对生殖和性功能有重要作用，也影响例如骨骼的其它器官。
2、在免疫化学发光试剂的开发中，小分子抗原的检测往往采用竞争法来实现，相关的检测项目譬如睾酮(testosterone)，孕酮(progesterone)，雌二醇(estradiol)，维生素d(vitamin d)，维生素b12(vitamin b12)，t3，t4等项目。在进行检测时，样本里面的小分子抗原和试剂体系里面的小分子抗原共同竞争反应体系里面抗体的结合位点。试剂体系里面的小分子抗原往往是经过修饰的可以和固相体系相结合的。为了和固相结合，小分子往往和生物素biotin连接在一起。然后实现了固相磁珠-生物素+小分子-抗体+标记物的反应通路，形成可以生成信号的一个复合体。样本里的小分子抗原越多，生物素+小分子和抗
3、临床上对雌二醇的测定一般使用竞争法进行，其反应原理大致如图1所示。现有的雌二醇竞争法试剂，试剂雌二醇的修饰主要借助牛血清白蛋白(bsa)，人血清白蛋白(has)或铜蓝蛋白(klh)作为载体蛋白进行桥接。从该结构的合成来讲，首先存在结构不确定，因为合成的时候主要还是通过载体蛋白上的伯胺基团来偶联，数量和偶联位置都不可控；并且还是在同一个蛋白上偶联生物素和雌二醇，两者之间的偶联比例不可控，导致该结构可能存在较大的批间差；其次从反应来讲，这个结构和样本中单纯的游离雌二醇有非常大的差异，导致试剂雌二醇和样本雌二醇两者和抗体的结合存在较大差异，譬如空间位阻，竞争关系难以构建并稳定。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供雌二醇的生物素偶联结构及其合成方法与应用，在雌二醇和生物素之间插入不同的peg间隔，实现了不同间隔长度的小分子偶联并验证其性能。
2、本专利技术为实现上述目的采用的技术方案为：
3、本专利技术提供了雌二醇的生物素偶联结构，包括estradiol-peg3-biotin或estradiol-peg11-biotin。
4、本专利技术还提供了雌二醇的生物素偶联结构的合成方法，包括：
5、estradiol-nhs和biotin-peg3-nh2以1：1.2的摩尔比例结合，室温反应1h，然后用c18柱色谱纯化，形成estradiol-peg3-biotin的结构；或者
6、estradiol-nhs和biotin-peg11-nh2以1：1.2的摩尔比例结合，室温反应1h，然后用c18柱色谱纯化，形成estradiol-peg11-biotin的结构。
7、优选地，所述estradiol-nhs通过以下方法合成：在mes(4-吗啉乙磺酸)酸性缓冲液中添加estradiol-6-cmo至最终浓度为2mg/ml，用同样的缓冲液溶解碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)，并添加碳二亚胺(edc)至最终浓度为2mmol/l，n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)最终浓度5mmol/l，室温反应半小时活化estadiol-6-cmo，形成estradiol-nhs结构。
8、优选地，所述mes酸性缓冲液浓度为0.1m，ph 4.5～5.5。
9、本专利技术另提供了雌二醇的生物素偶联结构在雌二醇检测试剂中的应用。
10、优选地，所述雌二醇检测试剂包括雌二醇的生物素偶联结构，链霉亲和素包被的磁珠，mes缓冲液，标记有吖啶酯的抗-雌二醇抗体。
11、更优选地，所述应用包括将雌二醇的生物素偶联结构用mes缓冲液稀释，当作样本加入反应体系，通过所述雌二醇的生物素偶联结构桥接磁珠和抗-雌二醇抗体，抗-雌二醇抗体上标记的吖啶酯产生的发光值与雌二醇的生物素偶联结构的浓度成正相关。
12、优选地，通过在雌二醇与生物素之间插入不同长度的peg-biotin实现了不同间隔长度的小分子偶联，与短链peg-biotin相比，雌二醇与生物素间隔较长的结构，其产生的信号较强，但相对不稳定。
13、本专利技术的有益效果在于：
14、相比现有结构，本专利技术提供的雌二醇的生物素偶联结构更为可控，一个雌二醇仅偶联一个生物素，并且雌二醇和生物素之间的距离可以通过连接子进行调整，不存在结构批间差的问题。另外仅对雌二醇本体进行了简单修饰，不存在空间位阻；即便存在空间位阻，连接子的存在和优化也可以大大减少这方面的作用。以此达到提高检测试剂灵敏度，降低批间差的作用。
15、本专利技术雌二醇的生物素偶联结构的合成路径均起始于estradio-6-cmo，省去了雌二醇本体结构的衍生，同时利用预先合成的不同长度的peg-biotin来解决不同长度的连接子问题；通过不同长度的研究，我们发现小分子偶联效果要远远优于载体蛋白的偶联，其发光值要远远高于载体蛋白偶联；同时，相比短链，长链的偶联会产生较强的信号发光值，但两者有较强的相关性；相比短链，长链的偶联的稳定性相对较差，可能原因是长链peg的存在导致了胶束的产生，保护了雌二醇的结构，导致抗体无法结合。从试剂开发角度，在进行雌二醇试剂构建时可通过筛选合适的间隔，在保证信号强度的前提下获得一个相对稳定的结构。
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1.雌二醇的生物素偶联结构，包括Estradiol-PEG3-Biotin或Estradiol-PEG11-Biotin。
2.雌二醇的生物素偶联结构的合成方法，包括：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述Estradiol-NHS通过以下方法合成：在Mes酸性缓冲液中添加Estradiol-6-CMO至最终浓度为2mg/mL，用同样的缓冲液溶解碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺酯，并添加碳二亚胺至最终浓度为2mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺酯最终浓度5mmol/L，室温反应半小时活化Estadiol-6-CMO，形成Estradiol-NHS结构。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述Mes酸性缓冲液浓度为0.1M，pH4.5～5.5。
5.权利要求1所述的雌二醇的生物素偶联结构或权利要求2～4任意一项所述的合成方法合成的雌二醇的生物素偶联结构在雌二醇检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述雌二醇检测试剂包括雌二醇的生物素偶联结构，链霉亲和素包被的磁珠，Mes缓冲液，标记
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括将雌二醇的生物素偶联结构用Mes缓冲液稀释，当作样本加入反应体系，通过所述雌二醇的生物素偶联结构桥接磁珠和抗-雌二醇抗体，抗-雌二醇抗体上标记的吖啶酯产生的发光值与雌二醇的生物素偶联结构的浓度成正相关。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过在雌二醇与生物素之间插入不同长度的PEG-Biotin实现了不同间隔长度的小分子偶联，与短链PEG-Biotin相比，雌二醇与生物素间隔较长的结构，其产生的信号较强，但相对不稳定。
...【技术特征摘要】
1.雌二醇的生物素偶联结构，包括estradiol-peg3-biotin或estradiol-peg11-biotin。
2.雌二醇的生物素偶联结构的合成方法，包括：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述estradiol-nhs通过以下方法合成：在mes酸性缓冲液中添加estradiol-6-cmo至最终浓度为2mg/ml，用同样的缓冲液溶解碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺酯，并添加碳二亚胺至最终浓度为2mmol/l，n-羟基琥珀酰亚胺酯最终浓度5mmol/l，室温反应半小时活化estadiol-6-cmo，形成estradiol-nhs结构。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述mes酸性缓冲液浓度为0.1m，ph4.5～5.5。
5.权利要求1所述的雌二醇的生物素偶联结构或权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：李沛，许秀坤，田腾飞，周超，
申请(专利权)人：苏州派博思生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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