【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化检测，涉及碱性磷酸酶快速标记试剂盒及方法。
技术介绍
1、生物偶联是通过化学键共价结合两个或多个分子或生物大分子的过程。该技术利用多种化学试剂进行蛋白和多肽的交联，固定，修饰和标记。因多数需保留蛋白活性，其反应往往在比较温和可控条件下进行。在众多的偶联需求中，碱性磷酸酶和抗体的偶联是最为广泛使用的一个场景。免疫化学发光试剂的开发，免疫组化试剂的开发，甚至dna分子，都可以用碱性磷酸酶进行标记并进行后端的各种各样的应用。
2、偶联大多数是通过偶联试剂进行。偶联试剂含有具有反应活性的末端，可与蛋白或其他分子上的特定功能基团如伯氨基、巯基反应，使用最广泛的当属与伯胺反应的琥珀酰亚胺(nhs)基团以及与巯基反应的马来酰亚胺(mi，maleimide)基团。通过偶联剂的组合可形成多种偶联方案，譬如两头均为nhs基团的同型双功能连接子，可以连接蛋白和碱性磷酸酶，但非常容易产生不希望的结构且偶联效率偏低。最广泛应用的当属在抗体或碱性磷酸酶上通过伯胺基团添加活性基团a，然后在另一个抗体或碱性磷酸酶上添加另外的活性基团b，然后两个活性基团a和b反应以完成偶联，这种方式不会产生不希望的结构。
3、现有的手段经常是通过一些连接子，先将抗体和碱性磷酸酶活化，甚至直接通过同型双功能连接子，在抗体和碱性磷酸酶之间创造无间隔的连接，实现共价偶联。但现有这种反应模式一般需要对抗体进行脱盐置换缓冲液，活化后需再次置换缓冲液；对碱性磷酸酶也采用类似的脱盐置换流程。该操作相对比较复杂，需要用到色谱纯化等工具，耗时耗力，整个流
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了碱性磷酸酶快速标记试剂盒及方法，采用了超滤的方式对抗体进行缓冲液置换，对活化的碱性磷酸酶进行冻干以稳定，可以仅实现抗体-碱性磷酸酶的偶联结构，整个标记偶联过程可以在3～4小时内完成，大大缩短实现广泛的目标蛋白偶联的时间。
2、本专利技术为实现上述目的采用的技术方案为：
3、本专利技术提供了碱性磷酸酶快速标记试剂盒，包括：蛋白活化缓冲液、蛋白活化剂、蛋白偶联缓冲液、冻干碱性磷酸酶和超滤管。
4、优选地，所述蛋白活化缓冲液含有浓度为50mmol/l的十水四硼酸钠，碱性。更优选ph＝8.5～9.5。
5、优选地，所述蛋白活化剂采用sata或traut试剂。用于为蛋白添加巯基基团。
6、优选地，所述蛋白偶联缓冲液含有浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲液，中性。
7、优选地，所述超滤管的截留分子量为30kd。
8、本专利技术中，碱性磷酸酶可以是天然的，也可以是各种重组的碱性磷酸酶；碱性磷酸酶通过偶联剂活化，在其表面的伯胺基团上添加马来酰亚胺；然后通过分子排阻色谱纯化并脱盐。
9、优选地，所述冻干碱性磷酸酶的表面添加有至少3个活性基团。即平均一摩尔碱性磷酸酶上面连接的基团数不应小于三摩尔。
10、优选地，所述冻干碱性磷酸酶采用在添加糖类保护剂的条件下冻干并且复溶后保持蛋白含量及活性基团数量不变的碱性磷酸酶。保护剂可以为甘露醇(浓度为5％-10％)，葡萄糖(浓度为5％-10％)等不影响下一步使用的物质。
11、本专利技术还提供了碱性磷酸酶快速标记方法，包括：
12、(1)向超滤管中加入蛋白活化缓冲液润洗超滤管，离心；
13、(2)向超滤管中加入设定量的抗体后，添加蛋白活化缓冲液，混匀，离心；再加入蛋白活化缓冲液重悬抗体；
14、(3)用蛋白活化缓冲液溶解蛋白活化剂，添加到抗体中，混匀，室温反应45～60min；
15、(4)反应结束后加入蛋白偶联缓冲液混匀，离心，然后加入蛋白偶联缓冲液再次充分混匀；
16、(5)再次离心以充分去除游离的蛋白活化剂，后加入蛋白偶联缓冲液重悬抗体；
17、(6)用纯水复溶冻干碱性磷酸酶，溶解后全部转移到超滤管中，充分混匀，室温反应45～60min。
18、优选地，步骤(2)中，按照抗体声称浓度计算抗体体积，得到设定量的抗体。
19、优选地，步骤(6)中每隔10min反复吹打几次以提高反应效率。
20、优选地，所述方法还包括步骤(6)反应结束后加入蛋白保存液，离心，再加入蛋白保存液，充分悬浮抗体。
21、优选地，所述方法中，所述离心均采用8000g离心5min。
22、本专利技术的有益效果在于：
23、一、不会产生不需要的结构，活化剂仅活化抗体或目标蛋白，因此只能和碱性磷酸酶的活性基团反应，不会产生抗体-抗体的结构和酶-酶的结构；
24、二、提供了碱性磷酸酶活化后的稳定形式，碱性磷酸酶的活化可以和蛋白或抗体的活化在时间和空间上分开，使得整个流程更加灵活；
25、三、采用超滤来脱盐和置换缓冲液，最大限度的降低了操作难度和操作时间。
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1.碱性磷酸酶快速标记试剂盒，包括：蛋白活化缓冲液、蛋白活化剂、蛋白偶联缓冲液、冻干碱性磷酸酶和超滤管。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白活化缓冲液含有浓度为50mmol/L的十水四硼酸钠，碱性。
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白活化剂采用SATA或Traut试剂。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白偶联缓冲液含有浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液，中性。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述超滤管的截留分子量为30KD。
6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述冻干碱性磷酸酶的表面添加有至少3个活性基团。
7.根据权利要求1或6所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述冻干碱性磷酸酶采用在添加糖类保护剂的条件下冻干并且复溶后保持蛋白含量及活性基团数量不变的碱性磷酸酶。
8.碱性磷酸酶快速标记方法，包括：
9.根
10.根据权利要求8所述的碱性磷酸酶快速标记方法，其特征在于，所述离心均采用8000g离心5min。
...【技术特征摘要】
1.碱性磷酸酶快速标记试剂盒，包括：蛋白活化缓冲液、蛋白活化剂、蛋白偶联缓冲液、冻干碱性磷酸酶和超滤管。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白活化缓冲液含有浓度为50mmol/l的十水四硼酸钠，碱性。
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白活化剂采用sata或traut试剂。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述蛋白偶联缓冲液含有浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲液，中性。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶快速标记试剂盒，其特征在于，所述超滤管的截留分子量为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李沛，许秀坤，周超，田腾飞，
申请(专利权)人：苏州派博思生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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