【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，更具体地说，它涉及一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法。
技术介绍
1、牛初乳一般是指奶牛分娩后7d、特别是3d内所分泌的乳汁，含有许多生物活性物质，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、生长因子、细胞因子、乳过氧化氢酶和溶菌酶等。igg是牛初乳中含量最高的免疫球蛋白，也是最重要的免疫球蛋白，它占总ig的80％以上。igg能部分取代人类母乳siga的功能，是保健食品和医药产品中的功效成分之一。
2、血清是提取igg的主要原料，在血清制品，如静注人免疫球蛋白制剂中，igg是以单体形式存在，另外还含有少量的igg二聚体和多聚体。绝大部分igg二聚体是由igg分子间fab段特异结合形成的独特型-抗独特型抗体复合物。teelingjl等在itp模型小鼠研究中发现，输注单体igg或生理盐水后，小鼠血小板数量没有变化，但是输注含有较多含量的igg二聚体后，血小板数量迅速增加，据此推测，igg二聚体可以促进血小板数量的增殖，相较于igg单体，含有更高水平的igg二聚体和多聚体的ivig制剂能更好地改善itp症状。为了进一步开发igg二聚体的医学用途，需要开发igg二聚体的提取方法。
3、据报道，在牛初乳中含有相当量的igg二聚体，它的分子量和离子交换树脂的洗脱特性与siga非常相似，所以从牛初乳中制备siga总是受到igg二聚体的干扰，siga与igg二聚体这两种组分甚至用300cm长的sepharose6b柱，或在deae柱层析中也不能完全分离。
4、针对上述中的相关技术，专利技术人认为，
技术实现思路
1、相关技术中，采取传统的分离方式得到的igg二聚体纯度较差，难以满足实际需求。为了改善这一缺陷，本申请提供一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法。
2、本申请提供一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，采用如下的技术方案：
3、一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，该方法是将1-3d牛初乳依次通过离心脱脂、去酪蛋白、盐析、丙烯葡聚糖凝胶柱层析分离、葡琼凝胶柱层析分离后，获得分子量为362.9±1.8kda，纯度99％以上的免疫球蛋白g二聚体。
4、通过采用上述技术方案，本申请选取了1-3d牛初乳，先进性了离心脱脂、去酪蛋白以及盐析。之后，专利技术人偶然发现经过丙烯葡聚糖凝胶柱和葡琼凝胶柱的处理，能够得到igg二聚体含量较高的洗脱峰。经过验证发现，这两种凝胶柱的处理能够克服siga的干扰，使得igg二聚体相对独立地被分离出来，从而得到了纯度相对较高的igg二聚体。
5、作为优选，所述方法包括以下步骤：
6、(1)对牛初乳进行离心脱脂，去除上层脂肪和底部沉淀物，中间部分经过滤后得到初乳乳清，备用；
7、(2)取初乳乳清，加去离子水稀释并用盐酸调节ph至4.4-4.6，搅拌后静置，然后离心并去除沉淀，保留上清液，将上清液的ph调整到6.3-6.8；
8、(3.1)在搅拌条件下将饱和硫酸铵溶液加入上清液中，使硫酸铵达到40％饱和度，然后冷藏静置，经过离心之后弃上清液并保留沉淀物；
9、(3.2)用pbs溶解(3.1)的沉淀物，再加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵达35％饱和度，然后冷藏静置，经过离心后得到上清液；
10、(3.3)对(3.2)的上清液，按上述条件再进行一次35％饱和度的硫酸铵盐析，经过离心之后弃上清液并保留沉淀物，备用；
11、(4)将沉淀用含有氯化钠的pbs溶解，经过离心后将上清液加到丙烯葡聚糖凝胶柱上，用pbs进行洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，得到3个洗脱峰，收集峰2，将这部分合并，加硫酸铵溶液达35％饱和度，然后冷藏静置过夜；
12、(5.1)将峰2的硫酸铵沉淀部分用pbs溶解，经过离心后取上清液，将上清液加到葡琼凝胶柱中进行洗脱，收集第二洗脱峰；
13、(5.2)将(5.1)的第二洗脱峰合并，加硫酸铵溶液达35％饱和度，冷藏静置，经过离心后取35％饱和度的硫酸铵沉淀，用pbs溶解后，再加入葡琼凝胶柱中进行层析分离，收集洗脱的蛋白峰，将该蛋白峰合并；
14、(5.3)在冷藏条件下分别用pbs和蒸馏水对(5.2)合并的蛋白峰透析过夜，将透析液离心去沉淀物后在冷冻干燥机上冻干，得到免疫球蛋白g二聚体。
15、作为优选，所述步骤(3.1)的具体操作为，在搅拌条件下将饱和硫酸铵溶液加入上清液中，使硫酸铵达到40％饱和度，然后冷藏静置，，以4000r/min的速度离心15min或以6000r/min的速度离心10min，弃上清液并保留沉淀物。
16、作为优选，所述步骤(3.2)的具体操作为，用相当于上清液一半体积的10mmol/l磷酸盐缓冲液(ph7.4)溶解(3.1)的沉淀物，再加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵达35％饱和度，然后冷藏静置，经过离心后得到上清液。
17、作为优选，所述步骤(3.3)的具体操作为，对(3.2)的上清液，按上述条件再进行一次35％饱和度的硫酸铵盐析，以4000r/min的速度离心15min，之后弃上清液并保留沉淀物，备用。
18、作为优选，所述步骤(4)中，pbs中的氯化钠浓度为0.1-0.2mol/l。
19、作为优选，所述步骤(4)中，用部分收集器进行分部收集时，将流速控制在0.5-1ml/min。
20、作为优选，所述步骤(5.1)的具体操作为，将峰2的硫酸铵沉淀部分用pbs充分溶解，于10000r/min离心10min，取上清液加到葡琼凝胶柱中，以1ml/min的速度进行洗脱，收集第二洗脱峰。
21、作为优选，所述5.2的具体操作为，将收集的第二洗脱峰合并，加硫酸铵溶液达35％饱和度，4℃冷藏静置，4000r/min离心15min，取35％的硫酸铵沉淀，用pbs溶解后，再经一次葡琼凝胶柱层析分离，在此条件下只有一个蛋白峰(峰值为51管)被洗脱下来，将该蛋白峰合并。
22、作为优选，所述5.3的具体操作为，用截留分子量为8000da透析袋，在冷藏条件下分别用pbs和蒸馏水对(5.2)合并的蛋白峰透析过夜，将透析液离心去沉淀物后在冷冻干燥机上冻干，得到免疫球蛋白g二聚体。
23、综上所述，本申请具有以下有益效果：
24、1、本申请通过对凝胶柱层析分离方式的优选，获得了能够克服siga干扰的凝胶柱组合，即先进行丙烯葡聚糖凝胶柱层析分离，再进行葡琼凝胶柱层析分离。通过上述凝胶柱的处理，igg二聚体能够被相对独立地提取出来，克服了siga与igg二聚体用300cm长的sepharose6b柱，或在deae柱层析中也不能完全分离本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，该方法是将1-3d牛初乳依次通过离心脱脂、去酪蛋白、盐析、丙烯葡聚糖凝胶柱层析分离、葡琼凝胶柱层析分离后，获得分子量为362.9±1.8kDa，纯度99%以上的免疫球蛋白G二聚体。
2.根据权利要求1所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（3.1）的具体操作为，在搅拌条件下将饱和硫酸铵溶液加入上清液中，使硫酸铵达到40%饱和度，然后冷藏静置，以4000r/min的速度离心15min或以6000r/min的速度离心10min，弃上清液并保留沉淀物。
4.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（3.2）的具体操作为，用相当于上清液一半体积的10mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）溶解（3.1）的沉淀物，再加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵达35%饱和度，然后冷藏静置，经过离心后得到上清液。
6.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，PBS中的氯化钠浓度为0.1-0.2mol/L。
7.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，用部分收集器进行分部收集时，将流速控制在0.5-1mL/min。
8.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（5.1）的具体操作为，将峰2的硫酸铵沉淀部分用PBS充分溶解，于10000r/min离心10min，取上清液加到葡琼凝胶柱中，以1mL/min的速度进行洗脱，收集第二洗脱峰。
9.根据权利要求1所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述5.2的具体操作为，将收集的第二洗脱峰合并，加硫酸铵溶液达35%饱和度，4℃冷藏静置，4000r/min离心15min，取35%的硫酸铵沉淀，用PBS溶解后，再经一次葡琼凝胶柱层析分离，在此条件下只有一个蛋白峰（峰值为51管）被洗脱下来，将该蛋白峰合并。
10.根据权利要求1所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G二聚体的方法，其特征在于，所述5.3的具体操作为，用截留分子量为8000Da透析袋，在冷藏条件下分别用PBS和蒸馏水对（5.2）合并的蛋白峰透析过夜，将透析液离心去沉淀物后在冷冻干燥机上冻干，得到免疫球蛋白G二聚体。
...【技术特征摘要】
1.一种从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，其特征在于，该方法是将1-3d牛初乳依次通过离心脱脂、去酪蛋白、盐析、丙烯葡聚糖凝胶柱层析分离、葡琼凝胶柱层析分离后，获得分子量为362.9±1.8kda，纯度99%以上的免疫球蛋白g二聚体。
2.根据权利要求1所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（3.1）的具体操作为，在搅拌条件下将饱和硫酸铵溶液加入上清液中，使硫酸铵达到40%饱和度，然后冷藏静置，以4000r/min的速度离心15min或以6000r/min的速度离心10min，弃上清液并保留沉淀物。
4.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（3.2）的具体操作为，用相当于上清液一半体积的10mmol/l磷酸盐缓冲液（ph7.4）溶解（3.1）的沉淀物，再加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵达35%饱和度，然后冷藏静置，经过离心后得到上清液。
5.根据权利要求2所述的从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g二聚体的方法，其特征在于，所述步骤（3.3）的具体操作为，对（3.2）的上清液，按上述条件再进行一次35%饱和度的硫酸铵盐析，以4000r/min 的速度离心15min，之后弃上清液并保留沉淀物，备用。
【专利技术属性】
技术研发人员：程光宇，葛文金，陈朝，
申请(专利权)人：江苏天美健大自然生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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