【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学显微镜成像，特别涉及一种利用光学方式和数据处理技术对三维方向上的荧光信息进行编码和解码来突破光学衍射极限，实现光学显微镜的三维超分辨成像方法。
技术介绍
1、光学显微镜是生命科学等相关领域研究的常用工具，可以用来观察细胞器之间的动态互作过程，揭示生理病理现象背后的机制，因此对活细胞和组织研究起着重要的作用，生物细胞是存在于空间的三维结构，但是由于光学衍射极限的存在，传统光学显微镜的分辨率受到了限制，在可见光波段横向分辨率为200-300nm、轴向分辨率为500-800nm，由于许多细胞器结构，以及细胞器间相互作用的动态过程的空间尺度小于衍射极限，因此在三维方向上突破光学衍射极限是一个重要的研究需求。
2、在过去三十年，研究人员提出了许多基于荧光开关效应和单分子定位的超分辨显微成像技术，将横向分辨率和轴向分辨率分别提高了至少10倍和6倍，目前，远场超分辨显微成像主要包括三种技术，第一种技术以受激辐射损耗显微术为代表；第二种技术以单分子定位显微术为主，其代表性技术有光激活定位显微和随机光学重构显微镜；第三种技术是结构光照明显微镜技术，三种技术对比而言，sted比sim具有更好的分辨率，比smlm具有更快的成像速度，但由于种种原因，三维超分辨成像技术的发展仍然十分缓慢，传统的三维超分辨成像的实现通常需要添加大量光电子器件，使得光学成像系统极其复杂和不稳定，这给活细胞三维成像的应用带来了挑战。
3、总之，目前的三维超分辨成像技术仍然面临成像系统复杂、成本高、图像质量差和样品制备过程复杂，以及需要
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其优点是通过激光脉冲调制和波前调制技术对荧光信号进行编码，然后利用频域相量分析对已编码信号进行解调，结合三维扫描实现三维超分辨成像，该方法基于传统的三维激光扫描共聚焦显微镜系统，只需增加时间分辨探测模块和两条额外的光路，为细胞和活体三维超分辨成像研究提供技术支撑，结合了光学方式和数据处理技术，通过高斯和笼式脉冲激光在纳秒尺度的时间内对样品重复激发进行编码，利用时间相关单光子计数器模块采集荧光分子的时空信息，然后利用基于频域相量分析的光子提取方法进行荧光信号解码，进而在传统的共聚焦显微镜系统中实现三维超分辨成像。
2、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，包括基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统，基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统包括：
3、激光器，由皮秒激光器产生脉冲型激发光；
4、半波片，用于调节激光的偏振方向；
5、起偏器，用于激光分束，与半波片配合使用可以控制出射激光的能量比例；
6、反射镜，用于改变激光的传输方向；
7、分光镜，用于激光分束或合束；
8、涡旋玻片，用于对激光进行波前调制，将高斯光转换成横向空心光；
9、0/π相位板，用于对激光进行波前调制，将高斯光转换成轴向空心光；
10、角反射器，用于调节高斯激光和两束空心激光之间的脉冲间隔，即移动角反射器的位置同时延长或缩短两束空心激发光斑的光程，在时间上控制两束空心激光到达样品的时间；
11、双色镜，用于透射高斯和两束空心激发光，反射荧光信号；
12、扫描振镜，用于对三束激发光进行同步扫描，实现对样品的面阵共聚焦成像；
13、扫描透镜，放置于扫描振镜之后，用于收集面阵扫描的激光光束；
14、管镜，与物镜搭配构成显微镜系统；
15、物镜，用于将激光聚焦到样品，同时收集样品反射回来的荧光信号；
16、载物台，用于放置和固定样品，并对样品进行三维移动控制；
17、透镜，用于对光束进行聚焦；
18、滤光片，用于去除荧光以外的杂散光，提高图像信噪比；
19、探测器，使用光电倍增管或雪崩光电二极管，用于收集信号并对荧光信号进行放大；
20、高速光电二极管探测器，用于探测第一个起偏器反射的激光，作为荧光时间分辨探测的参考信号；
21、时间相关单光子计数器，用于荧光时间分辨探测，记录编码后荧光信号的三维时空信息；
22、电脑，用于控制软件采集图像，存储数据和图像数据处理等。
23、本专利技术进一步设置为：激光出射后经过第一个起偏器分为两束，其中反射光被高速光电二极管探测器探测，用作荧光时间分辨探测时的参考信号，另一束透射后经过第二起偏器分束，第二起偏器的透射光和反射光均为高斯激光，反射的光束经过角反射器调节光程，再经过分光镜一分为二，其中，透射光经0-2π涡旋玻片调制后产生横向空心光，反射光经0/π相位板调制后产生轴向空心光，由于横向空心光和轴向空心光到达样品时的光程相同，因此这两束光的激光脉冲在同一时刻照射到样品，两束空心光在三维空间上组成一个空心的笼式光斑，高斯光斑和笼式光斑在第三个分光镜处重合，样品被激发后发出荧光信号，荧光信号被物镜收集后原路返回，经双色镜反射后依次经过透镜和滤光片到达探测器，将探测器采集的荧光信号传输至时间相关单光子计数器，并将数据保存至电脑。
24、本专利技术进一步设置为：通过前后移动角反射器的位置来调节高斯光斑和笼式光斑之间的脉冲间隔。
25、本专利技术进一步设置为：调节激光在光路中传输的光程，利用具有一定排列特征的激光脉冲序列对荧光光子的自发辐射跃迁过程进行编码，使用基于时间相关单光子模块的荧光时间分辨探测技术记录光子发射过程中纳秒尺度的时间信息和纳米尺度的空间信息，最后结合频域相量分析技术对荧光信号的时空信息进行解码。
26、本专利技术进一步设置为：在相同的成像系统和物镜下，所有激发光斑充满物镜入瞳时，两束空心光的光斑尺寸在空间上均大于高斯光斑；
27、在相同的入射能量下，轴向空心光斑的焦平面强度小于横向空心光斑，在空间上，横向空心光和轴向空心光组成了一个中心强度为零的笼式光斑，经过光学系统校准和调试，使三束激发光斑在三维空间上完全重合。
28、本专利技术进一步设置为：横向空心光和轴向空心光的焦平面重合且光程相同，因此其脉冲序列相互重叠，在同一时刻到达样品，高斯光和笼式光之间的脉冲间隔可以通过角反射器进行控制，具体的数值与荧光染料的荧光寿命有关，可以根据相应染料的荧光寿命进行调节。
29、本专利技术进一步设置为：高斯光斑和笼式光斑在空间上精准重合，高斯光斑中心强度最大，而笼式光斑的中心强度为零，对荧光染料标记后的样品进行荧光寿命成像，采集并分析荧光光子的时空信息。
30、本专利技术进一步设置为：编码后荧光信息在时间上的分布情况，根据光子数分布可以将空间坐标分为六个区域：<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，包括基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统，其特征在于：基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统包括：
2.根据权利要求1所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：激光出射后经过第一个起偏器分为两束，其中反射光被高速光电二极管探测器探测，用作荧光时间分辨探测时的参考信号，另一束透射后经过第二起偏器分束，第二起偏器的透射光和反射光均为高斯激光，反射的光束经过角反射器调节光程，再经过分光镜一分为二，其中，透射光经0-2π涡旋玻片调制后产生横向空心光，反射光经0/π相位板调制后产生轴向空心光，由于横向空心光和轴向空心光到达样品时的光程相同，因此这两束光的激光脉冲在同一时刻照射到样品，两束空心光在三维空间上组成一个空心的笼式光斑，高斯光斑和笼式光斑在第三个分光镜处重合，样品被激发后发出荧光信号，荧光信号被物镜收集后原路返回，经双色镜反射后依次经过透镜和滤光片到达探测器，将探测器采集的荧光信号传输至时间相关单光子计数器，并将数据保存至电脑。
3.根据权利要求2所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，
4.根据权利要求1所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：调节激光在光路中传输的光程，利用具有一定排列特征的激光脉冲序列对荧光光子的自发辐射跃迁过程进行编码，使用基于时间相关单光子模块的荧光时间分辨探测技术记录光子发射过程中纳秒尺度的时间信息和纳米尺度的空间信息，最后结合频域相量分析技术对荧光信号的时空信息进行解码。
5.根据权利要求4所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：在相同的成像系统和物镜下，所有激发光斑充满物镜入瞳时，两束空心光的光斑尺寸在空间上均大于高斯光斑；
6.根据权利要求5所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：横向空心光和轴向空心光的焦平面重合且光程相同，因此其脉冲序列相互重叠，在同一时刻到达样品，高斯光和笼式光之间的脉冲间隔可以通过角反射器进行控制，具体的数值与荧光染料的荧光寿命有关，可以根据相应染料的荧光寿命进行调节。
7.根据权利要求6所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：高斯光斑和笼式光斑在空间上精准重合，高斯光斑中心强度最大，而笼式光斑的中心强度为零，对荧光染料标记后的样品进行荧光寿命成像，采集并分析荧光光子的时空信息。
8.根据权利要求7所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：编码后荧光信息在时间上的分布情况，根据光子数分布可以将空间坐标分为六个区域：
9.根据权利要求8所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：相量空间包含一个以坐标(0.5，0)为中心，半径为0.5的半圆轨迹，其中，坐标(0，0)代表了荧光寿命为无穷大，坐标(1，0)代表了荧光寿命为零，经频域转换后，空间域图像中每个像素对应相量空间的一个相量点，即空间坐标(x，y)转换为相量坐标(g，s)，所有相量点的集合形成一幅相量图，单组分样品的荧光寿命值必定落在这个半圆曲线上，而半圆上不同的位置(坐标)代表了不同的荧光寿命，因此，当样品中只有单个寿命成分存在时，相量中心坐标一定位于半圆曲线上，如果荧光发射包含两个或多个组分，相量中心坐标将不再位于半圆曲线上，相对于参考脉冲信号，笼式激光脉冲与高斯激光脉冲相比具有更大的时间延迟，因此在相量空间中表现为受笼式激光影响较大的区域内荧光信号的相量点相对于高斯激光中心区域的光子相量点具有更大的相位延迟，即更大的φ值，φ值的变化是本方法对荧光信号编码的结果，具有相似相位延迟(φ)和振幅调制度(m)的像素在相量图上聚集成群，其中，g＝m×cos(φ)，s＝m×sin(φ)，在相量图中，仅由高斯光激发的区域像素具有更小的φ值，因此更接近坐标(1，0)；
10.根据权利要求9所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：提取相量图中的所有信号(包括高频和低频信号)时，形成的三维图像仍然受光学衍射极限的限制，即非超分辨三维图像；
...【技术特征摘要】
1.一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，包括基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统，其特征在于：基于时间分辨探测的激光扫描共聚焦成像系统包括：
2.根据权利要求1所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：激光出射后经过第一个起偏器分为两束，其中反射光被高速光电二极管探测器探测，用作荧光时间分辨探测时的参考信号，另一束透射后经过第二起偏器分束，第二起偏器的透射光和反射光均为高斯激光，反射的光束经过角反射器调节光程，再经过分光镜一分为二，其中，透射光经0-2π涡旋玻片调制后产生横向空心光，反射光经0/π相位板调制后产生轴向空心光，由于横向空心光和轴向空心光到达样品时的光程相同，因此这两束光的激光脉冲在同一时刻照射到样品，两束空心光在三维空间上组成一个空心的笼式光斑，高斯光斑和笼式光斑在第三个分光镜处重合，样品被激发后发出荧光信号，荧光信号被物镜收集后原路返回，经双色镜反射后依次经过透镜和滤光片到达探测器，将探测器采集的荧光信号传输至时间相关单光子计数器，并将数据保存至电脑。
3.根据权利要求2所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：通过前后移动角反射器的位置来调节高斯光斑和笼式光斑之间的脉冲间隔。
4.根据权利要求1所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：调节激光在光路中传输的光程，利用具有一定排列特征的激光脉冲序列对荧光光子的自发辐射跃迁过程进行编码，使用基于时间相关单光子模块的荧光时间分辨探测技术记录光子发射过程中纳秒尺度的时间信息和纳米尺度的空间信息，最后结合频域相量分析技术对荧光信号的时空信息进行解码。
5.根据权利要求4所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：在相同的成像系统和物镜下，所有激发光斑充满物镜入瞳时，两束空心光的光斑尺寸在空间上均大于高斯光斑；
6.根据权利要求5所述的一种三维荧光信号编码超分辨显微成像方法，其特征在于：横向空心光和轴向空心光的焦平面重合且光程相同，因此其脉冲序列相互重叠，在同一时刻到达...
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