【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及生物合成，具体涉及一种细菌及真菌螺环二萜骨架，并进一步公开了可用于高效合成所述二萜骨架的酿酒酵母平台，以及基于所述酿酒酵母平台生物合成所述二萜骨架的方法及应用。
技术介绍
1、植物来源的萜类化合物具有广泛的商业和工业应用。萜类是最具结构多样性和功能多样性的天然产物，从中诞生了大量的药物和生物活性分子，如抗癌药物紫杉醇、抗疟疾药物青蒿素、天然香料檀香醇、抗氧化剂类胡萝卜素等。目前，萜类化合物的用途的主要包括专用燃料、农用化学品、香料、营养制品和药物等。然而，目前用于石油化工合成、提取和纯化来自天然植物来源的萜类化合物的方法具有有限的经济可持续性。
2、目前，植物、真菌中萜类报道较多，而细菌来源的萜类报道的较少。基于合成生物学思维，本领域研究者们已经打造了多种用于萜类高产表达的底盘细胞和元件单元去高效生产萜类骨架。如用于紫杉醇前体和青蒿素前体生产的大肠杆菌底盘和酿酒酵母底盘。然而，由于细菌萜类在大肠杆菌中遵循mev途径，不利于13c醋酸钠标记；在酿酒酵母底盘中遵循mva途径，但细菌来源的基因在兼容性上较却差，并影响其产量较低。
3、近年来，随着萜类天然产物生物合成途径的不断解析以及酶定向进化技术的发展，为深入研究萜类化合物的生物合成和工业生产奠定了重要基础。基于廉价原料为底物设计高效的生物合成策略制备萜类骨架(母核)，进而通过对这些母核分子的羟基化、环氧化、糖基化以及卤化等多种修饰作用，形成种类丰富的生物活性物质，可以有效弥补有机合成化学在复杂天然产物类药物生产方面的不足，实现化学合成
技术实现思路
1、为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种二萜类化合物骨架；
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种可高效合成所述二萜类化合物骨架的酿酒酵母平台，并进一步公开其构建方法；
3、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于所述酿酒酵母平台进行生物合成二萜类化合物骨架的方法。
4、为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种螺环二萜骨架，所述螺环二萜骨架包括如下式(ⅰ)所示的细菌二萜骨架(spcb)和/或如下式(ⅱ)所示的真菌二萜骨架(sdna)：
5、
6、本专利技术还公开了一种高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)过表达酿酒酵母mva途径中的限速酶idi和thmg，并加入ggpp合成酶sdnc，形成高产二萜骨架的酿酒酵母底盘；
8、(2)将细菌和真菌的二萜合成酶基因转入所述酿酒酵母底盘进行表达，并筛选新型细菌和真菌二萜骨架，即得。
9、具体的，所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，所述步骤(1)具体包括：
10、提取prs425质粒，用限制性内切酶xhoi和saci对所述prs425进行酶切并回收，备用；
11、提取酵母基因组，并pcr扩增酿酒酵母中的异构酶idi和thmg还原酶的基因；
12、pcr扩增二萜化合物生物合成过程中的ggpp合成酶基因sdnc；
13、将所述idi、thmg、sdnc基因及对应的启动子和终止子构建到prs425载体上，获得prs425(idi+thmg+sdnc)；
14、将构建好的prs425(idi+thmg+sdnc)转入到营养缺陷型酿酒酵母中获得酿酒酵母地盘。
15、具体的，所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，所述步骤(1)中，所述pcr扩增步骤的引物包括：
16、prs425-idi-f：
17、gtcaactgtcaattatattataatacactagatctatgactgccgacaacaata；
18、prs425-idi-r：
19、aaaaatcataaatcataagaaattcgcttatttatagcattctatgaatttgcctg；
20、prs425-thmg-f：
21、catacaatcaactatctaccataccataatacacaatgccgccgctattcaa；
22、prs425-thmg-r：
23、aattacatgatatcgacaaaggaaaaggggcctgtttaggatttaatgcaggtgacgg；；
24、prs425-sdnc-f：caacgaaaactcgagatgagtttcgaccaatttg；
25、prs425-sdnc-r：
26、gcagccttttgagcagccttggtaaccttagcggctcagaccctcaaaacctccacg。
27、具体的，所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，所述步骤(2)包括：
28、提取pyet质粒，用限制性内切酶mssi和kpni对所述pyet进行酶切并回收；
29、pcr扩增细菌来源的二萜合成酶spcb的dna序列和真菌来源的二萜合成酶sdna的cdna序列，并将其分别与对应的启动子和终止子构建到pyet载体上，分别获得载体pyet-spcb和pyet-sdna；
30、分别将所述pyet-spcb和pyet-sdna转入到步骤(1)构建的所述酿酒酵母地盘中进行表达。
31、具体的，所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，所述pcr扩增步骤的引物包括：
32、pyet-spcb-f：
33、ctatatcgtaataccatcatatggtgaccaccgcccgc；
34、pyet-spcb-r：cgtgaaggcatgtttaaactcatcgcgcgttcgcctccc；
35、pyet-sdna-f：ctatatcgtaataccatcatatgtcactatacgggttatt；
36、pyet-sdna-r：
37、cgtgaaggcatgtttaaacctaaggaagatccataatcctcgtct。
38、本专利技术还公开了一种由所述方法构建得到的高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台，包括酿酒酵母scrc01-01-spcb和/或scrc01-01-sdna。
39、本专利技术还公开了一种高效合成所述螺环二萜骨架的方法，包括将所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台进行发酵的步骤，以及，收集发酵液进行分析检测和/或结构鉴定的步骤。
40、具体的，所述高效合成所述螺环二萜骨架的方法，所述方法还包括通过投喂13c标记的醋酸钠探究所述螺环二萜骨架的合成机制的步骤。
41、本专利技术还公开了所述螺环二萜骨架用于制备萜类化合物的用途。
42、本专利技术所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台，通过表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种螺环二萜骨架，其特征在于，所述螺环二萜骨架包括如下式(Ⅰ)所示的细菌二萜骨架(SpcB)和/或如下式(Ⅱ)所示的真菌二萜骨架(SdnA)：
2.一种高效合成权利要求1所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：
4.根据权利要求3所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述PCR扩增步骤的引物包括：
5.根据权利要求2-4任一项所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：
6.根据权利要求5所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增步骤的引物包括：
7.一种由权利要求2-6任一项所述方法构建得到的高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台，其特征在于，包括酿酒酵母ScRC01-01-SpcB和/或ScRC01-01-SdnA。
8.一种高效
9.根据权利要求8所述高效合成所述螺环二萜骨架的方法，其特征在于，所述方法还包括通过投喂13C标记的醋酸钠探究所述螺环二萜骨架的合成机制的步骤。
10.权利要求1所述螺环二萜骨架用于制备萜类化合物的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种螺环二萜骨架，其特征在于，所述螺环二萜骨架包括如下式(ⅰ)所示的细菌二萜骨架(spcb)和/或如下式(ⅱ)所示的真菌二萜骨架(sdna)：
2.一种高效合成权利要求1所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：
4.根据权利要求3所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述pcr扩增步骤的引物包括：
5.根据权利要求2-4任一项所述高效合成所述螺环二萜骨架的酿酒酵母平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：
6.根据权利要求5所述高效合成所述螺...
【专利技术属性】
技术研发人员：戈惠明，刘双鹤，胡逸灵，孙佳丽，张琪，
申请(专利权)人：南京大学人工智能生物医药技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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