【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学检测，特别涉及一种基因检测试剂盒及基因检测方法。
技术介绍
1、目前进行用药相关位点基因分型检测的方法主要有：常规pcr扩增结合一代测序的方法、芯片法、arms-pcr法、荧光pcr法。常规pcr扩增结合一代测序，检测结果准确、技术成熟；但是操作比较费时，检测过程中开管容易造成实验环境污染，且一代测序成本较高，不适合大量开展。芯片法检测通量大，但是设计开发难度较大，操作要求高，需要特定的仪器，也容易造成环境污染，影响实验结果。arms-pcr法可以快捷实现检测，但是体系优化测试的难度较大，针对一个目标位点一般需要分两管进行检测，经济性较差。荧光pcr法进行基因分型检测，优点是检测操作便捷，但是要获得准确、特异的检测结果，也需要在优化测试阶段投入较多资源，一般需要针对每个检测目标位点设置两条探针，经济性也较差。
2、近年出现的荧光pcr熔解曲线法，是在普通荧光pcr方法的基础上，进行了部分改进，加入了熔解曲线程序段，基于检测探针和目标序列单链杂交的特征熔解峰中心温度(tm值)，对目标位点的基因型进行判断。理想的荧光pcr熔解曲线法检测体系，具有检测过程简单快捷、操作要求低、结果准确、成本低廉等优点，具有广泛的应用前景，尤其非常适合进行单位点的基因分型检测。但是目前该方法对前期优化测试的要求较高，否则在应用中容易出现熔解峰混乱、倒峰、融合峰等问题，无法准确判断结果，也无法保证检测的特异性。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是提出一种基因检测试剂盒及
2、为实现上述目的，本专利技术一方面提出一种基因检测试剂盒，用于检测人agbl4基因rs319952多态性，所述试剂盒包括pcr反应液；
3、所述pcr反应液包括：与agbl4基因rs319952多态性位点对应的上游引物、第一下游引物、第二下游引物和探针；
4、所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。
5、可选地，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
6、可选地，所述荧光报告基团包括fam、alexa fluor 488、tet、joe、hex、vic、cy3、rox、texas red、cy5和quasar 670中的至少一种；
7、所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2、dabcyl、tamra和eclipse中的至少一种。
8、可选地，所述pcr反应液还包括pcr缓冲溶液、dntps、盐溶液和pcr反应用酶。
9、可选地，所述pcr缓冲溶液包括tris-hcl、kcl、tritonx-100和formamide；
10、所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dutp；
11、所述盐溶液包括mgcl2；
12、所述pcr反应用酶包括dna聚合酶和ung酶。
13、可选地，所述上游引物和第一下游引物、第二下游引物以及探针的浓度分别为0.2μmol/l、0.2μmol/l、0.8μmol/l、0.6μmol/l。
14、可选地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品中含有所述人agbl4基因rs319952多态性位点的基因片段溶液，阴性对照品为te缓冲液。
15、本专利技术另一方面提供一种基因检测的方法，用于以非诊断目的检测人agbl4基因rs319952多态性，所述方法包括：
16、步骤s1：提取或释放待测样本的核酸；
17、步骤s2：使用如上文所述的基因检测试剂盒对步骤s1获得的核酸进行荧光定量pcr分析；
18、步骤s3：获得分析结果。
19、可选地，在步骤s2中，所述荧光定量pcr分析中pcr的反应条件为：
20、温度为50℃保持2min，温度为95℃保持3min；
21、温度为95℃保持15s，温度为55℃保持20s，温度为72℃保持30s，25个循环，在55℃退火阶段获取荧光信号；
22、温度为95℃保持15s，温度为60℃保持20s，温度为72℃保持30s，25个循环，在60℃退火阶段获取荧光信号；
23、温度为95℃保持30s，温度为40℃保持1min，以0.05℃/s的速率从40℃升温至90℃，且在此阶段采集荧光信号。
24、可选地，在步骤s2中，所述荧光定量pcr分析中基因分型与熔解峰中心温度tm值的关系如下：
25、检测结果为野生型时，检出熔解峰为1个，熔解峰中心温度的tm值为57.5～60.5℃；
26、检测结果为突变型时，检出熔解峰为1个，熔解峰中心温度的tm值为62.5～65.5℃；
27、检测结果为杂合型时，检出熔解峰为2个，2个熔解峰中心温度的tm值分别为57.5～60.5℃、62.5～65.5℃。
28、本专利技术的技术方案中，提供的基因检测试剂盒实现了首次针对人agbl4基因rs319952多态性位点的分型检测，可以快捷准确的针对人agbl4基因rs319952多态性位点进行分型检测。其具有检测速度快、操作步骤少、检测成本低、样本适应性好等优势。并且，本专利技术采用三引物扩增体系，包括1条上游引物和2条下游引物，有利于在后续的熔解曲线程序段有足量的目标单链与检测探针杂交，从而增强探针解离过程中的荧光信号变化强度，实现特异性检测，能够有效优化检测效果，具有分析特异性高、熔解峰容易区分、结果易于判读等优势。
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1.一种基因检测试剂盒，其特征在于，用于检测人AGBL4基因rs319952多态性，所述试剂盒包括PCR反应液；
2.如权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、Alexa fluor 488、TET、JOE、HEX、VIC、Cy3、ROX、Texas Red、Cy5和Quasar 670中的至少一种；
4.如权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括PCR缓冲溶液、dNTPs、盐溶液和PCR反应用酶。
5.如权利要求4所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液包括Tris-HCl、KCl、TritonX-100和formamide；
6.如权利要求4所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物和第一下游引物、第二下游引物以及探针的浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.6μmol/L。
8.一种基因检测的方法，其特征在于，用于以非诊断目的检测人AGBL4基因rs319952多态性，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述荧光定量PCR分析中PCR的反应条件为：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述荧光定量PCR分析中基因分型与熔解峰中心温度Tm值的关系如下：
...【技术特征摘要】
1.一种基因检测试剂盒，其特征在于，用于检测人agbl4基因rs319952多态性，所述试剂盒包括pcr反应液；
2.如权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团包括fam、alexa fluor 488、tet、joe、hex、vic、cy3、rox、texas red、cy5和quasar 670中的至少一种；
4.如权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液还包括pcr缓冲溶液、dntps、盐溶液和pcr反应用酶。
5.如权利要求4所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述pcr缓冲溶液包括tris-hcl、kcl、tritonx-100和formamide；
...【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑彦，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：
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