【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于稻瘟病菌检测，具体涉及一种快速精准检测稻瘟病菌的引物探针组及其应用。
技术介绍
1、水稻是人类重要的粮食作物之一，耕种与食用的历史都相当悠久。全世界有一半的人口食用稻，主要在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区。中国是水稻的原产地之一，中国南方地区农田多以水田为主，粮食作物以种植水稻为主。
2、稻瘟病是由稻瘟病原菌引起的、发生在水稻上的一种病害，流行年份，一般减产10-20％，重的达40-50％，局部田块甚至颗粒无收。稻瘟病在水稻整个生育期中都可发生，危害秧苗、叶片、穗、节等，分别称为苗瘟、叶瘟、穗瘟和节瘟。苗瘟多由种子带菌引起，致秧苗变褐枯死；叶瘟指田期稻株叶片发病，一般在水稻分蘖盛期盛发，病菌侵染叶片初期产生水溃状褐点，感病品种很快形成大的圆形或椭圆形褐斑，严重时病斑密布，叶片枯焦，全株中毒萎缩，根腐枯死；穗瘟发生于穗颈、穗轴、枝梗和谷粒上，病斑初期暗褐色，逐渐向上下扩展，形成水渍状褪绿病斑，最后变黑褐色，也有的后期呈枯白色，病斑长可达3-4厘米，穗颈瘟严重影响产量，始穗期发病的常造成白穗，全不结实；患节瘟水稻病节初为黑褐色小点，以后呈环状扩大至全节，变成黑色或黑褐色，后期病节干缩凹陷，易折断倒伏，并由于病组织干枯，不能输送水分和养料，影响结实和谷粒的饱满。因此在病害流行早期对发病植株进行快速准确检测，对于预测病害发生情况，及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少稻谷产量和质量损失具有重要的理论和实际意义。
3、随着分子生物学的发展，pcr技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种快速精准检测稻瘟病菌的引物探针组及其应用，
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了检测稻瘟病菌的引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物为rpa-mgg_15975f，其核苷酸序列为：
4、5’-cacaattctttctcgatttcctcaacatag-3'(seq id no:1)，所述反向引物为rpa-mgg_15975r，其核苷酸序列为：5’-cgtttattcgactttccaacgggtgcatga-3’(seq id no:2)；所述探针的核苷酸序列为：5’-attcaactgtcctacgtacgagcacgttacgtcaccttcca gaag-3’(seq id no:3)。
5、进一步地，所述rpa-mgg_15975r 5’端添加有生物素biotin，所述探针第30位碱基c与第31位碱基g之间添加有thf修饰，5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer。
6、通过采用上述技术方案，基于rpa反应设计了针对稻瘟病菌的检测引物和探针组合，该引物特异性强，扩增效果好，与其它病原菌无交叉反应，能够实现对稻瘟病菌的精准检测。
7、第二方面，本专利技术还提供了一种快速精准检测稻瘟病菌的rpa-lfd试剂盒，所述试剂盒包括至少1次用量的第一方面所述的引物和探针组合。
8、进一步地，所述rpa-lfd试剂盒中还包括标准阳性dna、缓冲液、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试剂。
9、通过采用上述技术方案，与常规pcr相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，只要有稳定的热源rpa反应就可以发生，极大的扩展了rpa使用的范围，摆脱了对热循环仪器的依赖，可以真正实现便携式的现场快速的稻瘟病菌检测。
10、第三方面，本专利技术还提供了一种快速精准检测稻瘟病菌的rpa-lfd方法，包括以下步骤：
11、1)提取待测样本的dna；
12、2)采用第一方面的引物和探针组合以所述dna为模板进行rpa扩增；
13、3)使用侧流层析试纸条进行检测，试纸条出现两条条带，一条蓝色位于质控区内，一条红色或粉红色位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有稻瘟病菌；当试纸条只有质控区出现一条蓝色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有稻瘟病菌。
14、进一步地，所述步骤2)中rpa扩增：反应管中的反应体系为50μl，包含25μl反应缓冲液rehydration buffer，10μm rpa-mgg_15975f和生物素标记的rpa-mgg_15975r各2.1μl，探针10μm rpa-mgg_15975probe 0.6μl，待测模板dna 2.0μl，无菌双蒸水15.2μl，将上述组分混匀后加入到50mg rpa冻干酶粉中，随后加入3μl反应驱动液并颠倒混匀。
15、进一步地，所述反应体系在39℃温育4min，将反应管再次混匀，继续39℃温育16min。
16、第五方面，本专利技术还提供了第一方面所述的引物和探针组合或第二方面所述的试剂盒在检测稻瘟病菌中的应用。
17、进一步地，所述应用为结合侧流层析试纸条进行检测。
18、本专利技术相对于现有技术而言，无需在实验室内分离病原菌就可以实现对稻瘟病菌的实时监测，该方法方便、快捷。同时，本申请提供的检测引物和探针试剂盒，对稻瘟病菌的检测灵敏度可以达到10pg/μl，且具有特异性。本专利技术的检测方法还可用于稻瘟病菌的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治稻瘟病害具有十分重要的意义。
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1.检测稻瘟病菌的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物为RPA-MGG_15975F，其核苷酸序列为：
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述RPA-MGG_15975R 5’端添加有生物素Biotin，所述探针第30位碱基C与第31位碱基G之间添加有THF修饰，5’端添加有FAM，3’端添加有C3-spacer。
3.一种快速精准检测稻瘟病菌的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少1次用量的权利要求2所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒中还包括标准阳性DNA、缓冲液、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试剂。
5.一种快速精准检测稻瘟病菌的RPA-LFD方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的RPA-LFD方法，其特征在于，所述步骤2)中RPA扩增：反应管中的反应体系为50μL，包含25μL反应缓冲液Rehydration buffer，10μM RPA-M
7.根据权利要求6所述的RPA-LFD方法，其特征在于，所述反应体系在39℃温育4min，将反应管再次混匀，继续39℃温育16min。
8.权利要求1-2任一所述的引物和探针组合或权利要求3-4任一所述的试剂盒在检测稻瘟病菌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为结合侧流层析试纸条进行检测。
...【技术特征摘要】
1.检测稻瘟病菌的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物为rpa-mgg_15975f，其核苷酸序列为：
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述rpa-mgg_15975r 5’端添加有生物素biotin，所述探针第30位碱基c与第31位碱基g之间添加有thf修饰，5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer。
3.一种快速精准检测稻瘟病菌的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少1次用量的权利要求2所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述rpa-lfd试剂盒中还包括标准阳性dna、缓冲液、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试剂。
5.一种快速精准检测稻瘟病菌的rpa-lfd方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据...
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